CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה
Summary
פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.
Abstract
חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR) מקובצות באופן קבוע במודלים של בעלי חיים מאפשרות מניפולציה גנטית מדויקת לחקר תופעות פיזיולוגיות. דגי זברה שימשו כמודל גנטי יעיל לחקר שאלות רבות הקשורות למחלות תורשתיות, התפתחות וטוקסיקולוגיה ברמת האיברים והאורגניזמים. הודות לגנום של דגי הזברה המבוארים והממופים היטב, פותחו כלים רבים לעריכת גנים. עם זאת, היעילות של יצירה וקלות של זיהוי עריכות מדויקות באמצעות קריספר היא גורם מגביל. המתוארת כאן היא גישת knock-in מבוססת CRISPR-Cas9 עם זיהוי פשוט של עריכות מדויקות בגן האחראי על רה-פולריזציה של הלב וקשור להפרעה החשמלית, תסמונת Long QT (LQTS). גישת RNA (sgRNA) דו-מנחה זו מכניסה ומחליפה את רצף המטרה ומקשרת בין גן מדווח המקודד גנטית. התועלת של גישה זו מודגמת על ידי תיאור מדידות פנוטיפיות לא פולשניות של תפקוד חשמלי לבבי בזחלים מסוג בר ודגי זברה שעברו עריכה גנטית. גישה זו מאפשרת מחקר יעיל של גרסאות הקשורות למחלות באורגניזם שלם. יתר על כן, אסטרטגיה זו מציעה אפשרויות להחדרת רצפים אקסוגניים של בחירה, כגון גנים מדווחים, אורתולוגים או עורכי גנים.
Introduction
אסטרטגיות עריכת גנים מבוססות קריספר במודלים של בעלי חיים מאפשרות לחקור מחלות, התפתחות וטוקסיקולוגיה תורשתיות גנטית ברמת האורגניזם השלם 1,2,3. דגי זברה מספקים מודל רב עוצמה הקרוב יותר בהיבטים פיזיולוגיים רבים לבני אדם מאשר מודלים של תאים שמקורם בבני אדם4. מגוון רחב של כלים ואסטרטגיות גנטיות שימשו בדגי זברה הן לבדיקה גנטית קדימה5 והן לבדיקה גנטית הפוכה6. מיפוי גנטי מקיף וביאור בדגי זברה סייעו לגישות לעריכת גנים כטכניקה עיקרית להנדסת נוקאאוטים של גנים ממוקדים (KOs) ודפיקות מדויקות (KIs)7.
למרות זאת, יצירת עריכות KI מדויקות בדגי זברה מוגבלת על ידי יעילות נמוכה והקושי בזיהוי מדויק. למרות שנוקלאזות משפיעות דמויות גורם שעתוק (TALENs) שימשו בהצלחה ואופטימיזציה עבור KIs8, קריספר מספק אסטרטגיית עריכת גנים משופרת עם מיקוד sgRNA פשוט יותר. מחקרים רבים השתמשו בקריספר כדי ליצור KIs מדויקים בדגי זברה 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, אם כי עריכות אלה שנוצרו באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה בתיווך קריספר (HDR) נוטות להיות לא יעילות עם הצלחה פנימית נמוכה שיעורים הדורשים גנוטיפ כמסך ראשי 9,10,14,21. זה מדגים את הצורך במערכת KI CRISPR יעילה בדגי זברה, כמו גם במערכת אמינה בעלת תפוקה גבוהה לאיתור עריכות מדויקות.
מטרת המחקר הייתה לתאר פלטפורמה ליצירת גן לב מדויק KI בלבבות דגי זברה עם זיהוי פשוט ותפוקה גבוהה של עריכות מוצלחות. מתוארת גישת החלפת אקסון דו-sgRNA מבוססת CRISPR-Cas9, המבוססת על גישת TALEN8. גישה זו כוללת כריתה של רצף המטרה באמצעות מדריכי שני sgRNA והחלפה ברצף תבניות אקסוגני המכיל את ה-KI המעניין וכן גן כתב פנימי מקודד גנטית (איור 1). השילוב של כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית בתוך הרצף הפנימי של גן המטרה מאפשר זיהוי יעיל של עריכות חיוביות. לאחר מכן מתוארת פלטפורמה פנוטיפית להערכת התפקוד החשמלי של הלב בזחלים של דגי זברה לצורך אפיון לא פולשני של גרסאות הגנים הקשורות ל-LQTS תורשתי, הפרעה חשמלית לבבית הגורמת לאנשים למוות לבבי פתאומי.
גישות אלה ישפרו את הגישה והשימוש בעריכות גנים של דגי זברה KI כדי ליצור מודלים של מחלות תורשתיות ולתת מענה לשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, כגון מיפוי דפוסי ביטוי גנים וויסות התפתחותי. מאחר שלבבות דגי זברה מקבילים טוב יותר למאפיינים אלקטרופיזיולוגיים של הלב האנושי מאשר מודלים של מורין, הם עשויים להיות אטרקטיביים במיוחד כמערכת הניתנת למתיחה גנטית עבור מודלים של מחלות לב 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההנדסה של עריכות גנים מדויקות באמצעות CRISPR-Cas9 מאותגרת על ידי היעילות הנמוכה של מנגנוני HDR והזיהוי היעיל שלהם. כאן מתוארת גישה להחלפת אקסון דו-sgRNA המבוססת על CRISPR-Cas9 שמייצרת עריכות מדויקות בדגי זברה עם זיהוי חזותי פשוט של עריכות חיוביות. היעילות של גישה זו מודגמת על ידי יצירת עריכות מדויקות בג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק פרויקט מחקר של המכונים הקנדיים לבריאות (T.W.C.) ומענקי תגלית של המועצה למחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
