CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集
Summary
このプロトコルは、CRISPR-Cas9技術を使用してゼブラフィッシュ胚の正確なノックイン編集を容易にするアプローチを説明しています。表現型パイプラインは、QT延長症候群関連遺伝子変異をモデル化するためのこれらの技術の適用可能性を実証するために提示される。
Abstract
動物モデルにおけるクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)は、生理学的現象の研究のための正確な遺伝子操作を可能にします。ゼブラフィッシュは、遺伝性疾患、発生、および毒物学に関連する多くの質問を臓器および生物レベルで研究するための効果的な遺伝子モデルとして使用されてきました。よく注釈されマッピングされたゼブラフィッシュゲノムのために、遺伝子編集のための多数のツールが開発されてきた。ただし、CRISPRを使用して正確なノックイン編集を生成することの有効性と検出の容易さは制限要因です。ここでは、心臓の再分極に関与し、電気障害であるQT延長症候群(LQTS)に関連する遺伝子の正確な編集を簡単に検出するCRISPR-Cas9ベースのノックインアプローチについて説明します。この2つのシングルガイドRNA(sgRNA)アプローチは、標的配列を切除して置換し、遺伝的にコードされたレポーター遺伝子を結合します。このアプローチの有用性は、野生型および遺伝子編集ゼブラフィッシュ幼虫における心臓電気機能の非侵襲的表現型測定を記述することによって実証される。このアプローチにより、生物全体の疾患関連変異の効率的な研究が可能になります。さらに、この戦略は、レポーター遺伝子、オルソログ、遺伝子エディターなどの選択した外因性配列を挿入する可能性を提供します。
Introduction
動物モデルにおけるCRISPRベースの遺伝子編集戦略により、遺伝性疾患、発生、および毒物学を生物全体レベルで研究することができます1,2,3。ゼブラフィッシュは、マウスやヒト由来の細胞モデルよりも多くの生理学的側面でヒトに近い強力なモデルを提供します4。ゼブラフィッシュでは、フォワード5とリバースの両方の遺伝子スクリーニング6に、さまざまな遺伝的ツールと戦略が使用されてきました。ゼブラフィッシュの包括的な遺伝子マッピングとアノテーションは、標的遺伝子ノックアウト(KO)と精密ノックイン(KI)を設計するための主要な技術として、遺伝子編集アプローチを促進しました7。
それにもかかわらず、ゼブラフィッシュで正確なKI編集を生成することは、効率が低く、正確な検出が難しいために制限されています。転写因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)はKI8にうまく使用され最適化されていますが、CRISPRはより単純なsgRNAターゲティングで改善された遺伝子編集戦略を提供します。多くの研究がCRISPRを使用してゼブラフィッシュ9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20で正確なKIを生成していますが、CRISPRを介した相同性指向修復(HDR)によって生成されたこれらの編集は非効率的であり、本質的な成功率が低い傾向があります。一次スクリーニングとしてジェノタイピングを必要とする率9、10、14、21。これは、ゼブラフィッシュにおける効率的なKI CRISPRシステムと、正確な編集を検出するための信頼性の高いハイスループットシステムの必要性を示しています。
この研究の目的は、ゼブラフィッシュの心臓で正確な心臓遺伝子KIを生成するためのプラットフォームを記述し、成功した編集を簡単かつハイスループットに検出することでした。TALENアプローチ8に基づくCRISPR-Cas9ベースの2sgRNAエクソン置換アプローチが記載されている。このアプローチでは、2つのsgRNAガイドを使用して標的配列を切除し、目的のKIと遺伝的にコードされたイントロニックレポーター遺伝子を含む外因性のテンプレート配列で置き換えます(図1)。標的遺伝子のイントロニック配列内に遺伝的にコードされた蛍光レポーターを統合することで、ポジティブ編集の効率的な検出が可能になります。次に、ゼブラフィッシュ幼虫の心臓電気機能を評価するための表現型プラットフォームが説明され、遺伝性LQTS(個人を心臓突然死にかかりやすくする心臓電気障害)に関連する遺伝子変異の非侵襲的特徴付けが行われます。
これらのアプローチは、遺伝性疾患をモデル化し、遺伝子発現パターンのマッピングや発生制御などの生物学的および生理学的問題に対処するためのゼブラフィッシュKI遺伝子編集へのアクセスと使用を強化します。ゼブラフィッシュの心臓は、マウスモデルよりもヒトの心臓電気生理学的特性とよく平行しているので、心臓病モデリングのための遺伝的に扱いやすいシステムとして特に魅力的かもしれません7、22、23。
Protocol
ゼブラフィッシュを用いた研究は、サイモンフレーザー大学動物管理委員会およびカナダ動物飼育評議会の方針および手順に同意して実施され、プロトコル#1264K-18の下で完了した。 1. 精密編集のためのCRISPRコンポーネントの設計 KIターゲット部位を含む配列を切除するために使用される2sgRNAガイドを設計するには、まず目的の遺伝子のゼブラフィッ?…
Representative Results
この2sgRNAエクソン置換CRISPRアプローチの使用の成功は、ゼブラフィッシュの zkcnh6a 遺伝子におけるLQTS関連変異体R56Qを改変するための正確な編集の導入と簡単な検出によって強調されています。 図6 は、上記のようなCRISPR成分を1細胞胚期に注入した代表的な3dpf幼虫を示す。 図6A は、鋳型統合に成功した陽性レポーターとしての眼レンズに?…
Discussion
CRISPR-Cas9を使用した正確な遺伝子編集のエンジニアリングは、HDRメカニズムの効率の低さと効率的な検出によって課題となっています。ここでは、CRISPR-Cas9ベースの2sgRNAエクソン置換アプローチについて説明し、ポジティブ編集の簡単な視覚的検出によりゼブラフィッシュで正確な編集を生成します。このアプローチの有効性は、 zkcnh6a 遺伝子の正確な編集を生成することによって実証…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ衛生研究所研究プロジェクト助成金(TWC)およびカナダ自然科学工学研究評議会ディスカバリー助成金(TWC)の支援を受けました。
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
Cite This Article
Simpson, K. E., Faizi, S., Venkateshappa, R., Yip, M., Johal, R., Poburko, D., Cheng, Y. M., Hunter, D., Lin, E., Tibbits, G. F., Claydon, T. W. CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts. J. Vis. Exp. (187), e64209, doi:10.3791/64209 (2022).