CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집
Summary
이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.
Abstract
동물 모델에서 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)이 클러스터링되어 생리적 현상 연구를 위한 정확한 유전자 조작이 가능합니다. Zebrafish는 전체 장기 및 유기체 수준에서 유전성 질병, 발달 및 독성학과 관련된 수많은 질문을 연구하는 효과적인 유전 모델로 사용되었습니다. 주석이 잘 달리고 매핑된 제브라피쉬 게놈으로 인해 유전자 편집을 위한 수많은 도구가 개발되었습니다. 그러나 CRISPR을 사용하여 정확한 녹인 편집을 생성하는 효율성과 용이함은 제한 요소입니다. 여기에 설명된 것은 심장 재분극을 담당하고 전기 장애인 LQTS(Long QT 증후군)와 관련된 유전자에서 정밀한 편집을 간단하게 감지하는 CRISPR-Cas9 기반 녹인 접근 방식입니다. 이 2-단일 가이드 RNA(sgRNA) 접근법은 표적 서열을 절제 및 대체하고 유전적으로 암호화된 리포터 유전자를 연결합니다. 이 접근법의 유용성은 야생형 및 유전자 편집 제브라 피쉬 유충에서 심장 전기 기능의 비 침습적 표현형 측정을 설명함으로써 입증됩니다. 이 접근법은 전체 유기체에서 질병 관련 변이체의 효율적인 연구를 가능하게합니다. 또한, 이 전략은 리포터 유전자, 오르토로그 또는 유전자 편집자와 같은 외인성 선택 서열의 삽입 가능성을 제공합니다.
Introduction
동물 모델에서 CRISPR 기반 유전자 편집 전략을 사용하면 전체 유기체 수준 1,2,3에서 유전적으로 유전되는 질병, 발달 및 독성학을 연구할 수 있습니다. 제브라피쉬는 쥐 또는 인간 유래세포 모델보다 다양한 생리학적 측면에서 인간에게 더 가까운 강력한 모델을 제공합니다4. 광범위한 유전 도구와 전략이 제브라 피쉬에서 전진5 및 역 유전자 스크리닝6 모두에 사용되었습니다. 제브라피쉬의 포괄적인 유전자 매핑 및 주석은 표적 유전자 녹아웃(KO) 및 정밀 녹인(KI)을 엔지니어링하는 주요 기술로서 유전자 편집 접근 방식을 촉진했습니다7.
그럼에도 불구하고 제브라 피쉬에서 정확한 KI 편집을 생성하는 것은 낮은 효율성과 정확한 탐지의 어려움으로 인해 제한됩니다. 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs)가 KI8에 성공적으로 사용되고 최적화되었지만, CRISPR은 더 간단한 sgRNA 표적화로 개선된 유전자 편집 전략을 제공합니다. 수많은 연구에서 CRISPR을 사용하여 제브라피쉬 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20에서 정확한 KI를 생성했지만, CRISPR 매개 상동성 지향 복구(HDR)를 통해 생성된 이러한 편집은 낮은 내재적 성공으로 비효율적인 경향이 있습니다. 유전형 분석을 기본 화면으로 요구하는 비율 9,10,14,21. 이는 제브라피쉬의 효율적인 KI CRISPR 시스템과 정밀한 편집을 감지하기 위한 신뢰할 수 있는 고처리량 시스템의 필요성을 보여줍니다.
이 연구의 목표는 성공적인 편집의 간단하고 높은 처리량 검출을 통해 제브라 피쉬 심장에서 정확한 심장 유전자 KI를 생성하는 플랫폼을 설명하는 것이 었습니다. CRISPR-Cas9 기반 2-sgRNA 엑손 치환 접근법이 설명되며, 이는 TALEN 접근법8에 기초한다. 이 접근법은 2-sgRNA 가이드를 사용하여 표적 서열을 절제하고 관심 있는 KI와 유전적으로 암호화된 인트론 리포터 유전자를 포함하는 외인성 주형 서열로 대체하는 것을 포함합니다(그림 1). 표적 유전자 인트론 서열 내에 유전적으로 암호화된 형광 리포터를 통합하면 양성 편집을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 그런 다음 개인을 갑작스런 심장 사망에 걸리게하는 심장 전기 장애 인 유전 된 LQTS와 관련된 유전자 변이체의 비 침습적 특성화를 위해 제브라 피쉬 유충의 심장 전기 기능을 평가하기위한 표현형 플랫폼을 설명합니다.
이러한 접근법은 유전 질환을 모델링하고 유전자 발현 패턴 매핑 및 발달 조절과 같은 생물학적 및 생리학적 문제를 해결하기 위해 제브라피쉬 KI 유전자 편집에 대한 접근 및 사용을 향상시킬 것입니다. 제브라 피쉬 심장은 쥐 모델보다 인간 심장 전기 생리 학적 특성과 더 잘 평행하기 때문에 심장 질환 모델링을위한 유 전적으로 다루기 쉬운 시스템으로서 특히 매력적 일 수 있습니다 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9를 사용한 정밀한 유전자 편집 엔지니어링은 HDR 메커니즘의 낮은 효율성과 효율적인 검출로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 양성 편집을 직접 시각적으로 감지하여 제브라피쉬에서 정밀한 편집을 생성하는 CRISPR-Cas9 기반 2-sgRNA 엑손 대체 접근법에 대해 설명합니다. 이 접근법의 효능은 zkcnh6a 유전자에서 정확한 편집을 생성함으로써 입증됩니다. 이 논문은 유전자 편집 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 보건원 연구 프로젝트 보조금 (TWC)과 캐나다 디스커버리 보조금의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (TWC)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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