CRISPR-Cas9-medierte presise knock-in-redigeringer i sebrafiskhjerter

Summary

Denne protokollen beskriver en tilnærming for å legge til rette for presise knock-in-redigeringer i sebrafiskembryoer ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologi. En fenotypingspipeline presenteres for å demonstrere anvendeligheten av disse teknikkene for å modellere en Long QT Syndrome-assosiert genvariant.

Abstract

Grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) i dyremodeller muliggjør presis genetisk manipulasjon for studier av fysiologiske fenomener. Sebrafisk har blitt brukt som en effektiv genetisk modell for å studere en rekke spørsmål knyttet til arvelig sykdom, utvikling og toksikologi på hele organ- og organismenivå. På grunn av det godt kommenterte og kartlagte sebrafiskgenomet er det utviklet mange verktøy for genredigering. Imidlertid er effekten av å generere og enkelt å oppdage presise knock-in-redigeringer ved hjelp av CRISPR en begrensende faktor. Beskrevet her er en CRISPR-Cas9-basert knock-in tilnærming med enkel påvisning av presise redigeringer i et gen som er ansvarlig for hjerte-repolarisering og assosiert med den elektriske lidelsen, Long QT Syndrome (LQTS). Denne to-single-guide RNA (sgRNA) tilnærmingen excises og erstatter målsekvensen og kobler et genetisk kodet reportergen. Nytten av denne tilnærmingen er demonstrert ved å beskrive ikke-invasive fenotypiske målinger av hjertets elektriske funksjon i villtype og genredigerte sebrafisklarver. Denne tilnærmingen muliggjør effektiv studie av sykdomsassosierte varianter i en hel organisme. Videre gir denne strategien muligheter for innsetting av eksogene sekvenser av valg, for eksempel reportergener, ortologer eller genredaktører.

Introduction

CRISPR-baserte genredigeringsstrategier i dyremodeller muliggjør studier av genetisk arvelig sykdom, utvikling og toksikologi på hele organismenivå ^1,2,3. Sebrafisk gir en kraftig modell som er nærmere i mange fysiologiske aspekter til mennesker enn murine eller menneskeavledede cellemodeller⁴. Et omfattende utvalg av genetiske verktøy og strategier har blitt brukt i sebrafisk for^{både fremover 5} og omvendt genetisk screening⁶. Omfattende genetisk kartlegging og annotering i sebrafisk har gjort det lettere å redigere genredigeringsmetoder som en primær teknikk for å konstruere målrettede gen knockouts (KOs) og presise knock-ins (KIs)⁷.

Til tross for dette er generering av presise KI-redigeringer i sebrafisk begrenset av lav effektivitet og vanskeligheten med nøyaktig deteksjon. Selv om transkripsjonsfaktorlignende effektornukleaser (TALENs) har blitt brukt og optimalisert for KIs⁸, gir CRISPR en forbedret genredigeringsstrategi med enklere sgRNA-målretting. Tallrike studier har brukt CRISPR til å generere presise KIer i sebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20^, selv om disse redigeringene generert gjennom CRISPR-mediert homologi-rettet reparasjon (HDR) har en tendens til å være ineffektive med lav iboende suksess priser som krever genotyping som primærskjerm 9,10,14,21. Dette viser behovet for et effektivt KI CRISPR-system i sebrafisk, samt et pålitelig system med høy gjennomstrømning for å oppdage presise redigeringer.

Målet med denne studien var å beskrive en plattform for å generere et presist hjertegen KI i sebrafiskhjerter med enkel og høy gjennomstrømningsdeteksjon av vellykkede redigeringer. En CRISPR-Cas9-basert to-sgRNA eksonutskiftningsmetode er beskrevet, som er basert på en TALEN-tilnærming⁸. Denne tilnærmingen innebærer eksisjon av målsekvensen ved hjelp av to-sgRNA-guider og erstatning med en eksogen malsekvens som inneholder KI av interesse, samt et genetisk kodet intronisk reportergen (figur 1). Integrasjonen av en genetisk kodet fluorescerende reporter i målgenets introniske sekvens muliggjør effektiv påvisning av positive redigeringer. Deretter beskrives en fenotypingsplattform for vurdering av hjertets elektriske funksjon hos sebrafisklarver for ikke-invasiv karakterisering av genvariantene assosiert med arvelig LQTS, en hjerteelektrisk lidelse som disponerer individer for plutselig hjertedød.

Disse tilnærmingene vil forbedre tilgangen til og bruken av sebrafisk KI-genredigeringer for å modellere arvelige sykdommer og adressere biologiske og fysiologiske spørsmål, for eksempel kartlegging av genuttrykksmønstre og utviklingsregulering. Siden sebrafiskhjerter bedre parallelle menneskelige hjerteelektrofysiologiske egenskaper enn murine modeller, kan de være spesielt attraktive som et genetisk trekkbart system for hjertesykdomsmodellering 7,22,23.

Protocol

Studier med sebrafisk ble utført i samsvar med retningslinjene og prosedyrene til Simon Fraser University Animal Care Committee og Canadian Council of Animal Care og ble fullført under protokoll # 1264K-18. 1. Design av CRISPR-komponenter for presise redigeringer For å designe de to-sgRNA-guidene som vil bli brukt til å excise sekvensen som inneholder KI-målstedet, må du først identifisere sebrafiskortologen for genet av interesse.MERK: <strong class="xfig…

Representative Results

Den vellykkede bruken av denne to-sgRNA-eksonutskiftningen CRISPR-tilnærmingen fremheves av introduksjonen og den enkle deteksjonen av en presis redigering for å konstruere den LQTS-assosierte varianten, R56Q, i zkcnh6a-genet i sebrafisk. Figur 6 viser representative 3 dpf larver injisert på encellet embryostadium med CRISPR-komponenter som beskrevet ovenfor. Figur 6A viser tilstedeværelsen av YFP mVenus reporter genuttrykk i øyelinsen som en posit…

Discussion

Prosjekteringen av presise genredigeringer ved hjelp av CRISPR-Cas9 utfordres av den lave effektiviteten til HDR-mekanismer og deres effektive deteksjon. Her beskrives en CRISPR-Cas9-basert to-sgRNA eksonutskiftningsmetode som gir presise redigeringer i sebrafisk med enkel visuell deteksjon av positive redigeringer. Effekten av denne tilnærmingen er demonstrert ved å generere presise redigeringer i zkcnh6a-genet . Denne artikkelen viser hvordan hjertefunksjonen hos genredigerte sebrafisklarver kan vurderes ved…

Materials

Program
CRISPOR	TEFOR Infrastructure
ENSEMBL	European Bioinformatics Institute
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Micro-Manager	Open Source (Github)
NEBiocalculator	New England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well Plate	VWR
25 mm Petri Dish	VWR
Blackfly USB3 Camera	Teledyne FLIR
C1000 Thermal Cycler	Bio-Rad
Centrifuge 5415C	Eppendorf
EZNA Gel Extraction Kit	Omega Biotek
MAXIscript T7 Transcription Kit	Invitrogen
MaxQ 5000 Incubator	Barnstead Lab Line
Miniprep Kit	Qiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit	Invitrogen
ND1000 Spectrophotometer	Nanodrop
PCR Purification Kit	Qiagen
PLI 100A Picoinjector	Harvard Apparatus
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad
Stemi 305 Steroscope	Zeiss
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System	Bio-Rad
ZebTec Zebrafish Housing System	Tecniplast
SERVICES
Gene Synthesis	Genewiz
Sanger Sequencing	Genewiz
REAGENTS
10β Competent Cells	NEB
10X PCR Buffer	Qiagen
100 mM Nucleotide Mixture	ABM
Ampicillin	Sigma
BamHI Endonuclease w/ buffer	NEB
BsaI Endonuclease w/ buffer	NEB
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
EcoRI Endonuclease w/ buffer	NEB
Glycerol
HEPES	Sigma
HindIII Endonuclease w/ buffer	NEB
Kanamycin	Sigma
Methylene Blue	Sigma
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
MS-222 (Tricaine)	Sigma
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab)	Addgene
PmeI Endonuclease w/ buffer	NEB
SalI Endonuclease w/ buffer	NEB
Sodium Hydroxide	Sigma
T4 Ligase w/ buffer	Sigma
Taq Polymerase	Qiagen
TE Buffer	Sigma
Tris Hydrochloride	Sigma
XhoI Endonuclease w/ buffer	NEB
RECIPES
Solution	Component	Supplier
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0)	10 mM Tris	Sigma
	50 mM NaCl	Sigma
	1 mM EDTA	Sigma
E3 Media (pH 7.2)	5 mM NaCl	Sigma
	0.17 mM KCl	Sigma
	0.33 mM CaCl2	Sigma
	0.33 mM MgSO4	Sigma
Injection Buffer (pH 7.5)	20 mM HEPES	Sigma
	150 mM KCl	Sigma