Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra
Summary
Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.
Abstract
Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) en modelos animales permiten una manipulación genética precisa para el estudio de fenómenos fisiológicos. El pez cebra se ha utilizado como un modelo genético eficaz para estudiar numerosas cuestiones relacionadas con la enfermedad hereditaria, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el órgano y el organismo. Debido al genoma del pez cebra bien anotado y mapeado, se han desarrollado numerosas herramientas para la edición de genes. Sin embargo, la eficacia de generar y la facilidad de detectar ediciones precisas utilizando CRISPR es un factor limitante. Aquí se describe un enfoque knock-in basado en CRISPR-Cas9 con la detección simple de ediciones precisas en un gen responsable de la repolarización cardíaca y asociado con el trastorno eléctrico, el síndrome de QT largo (LQTS). Este enfoque de ARN de dos guías únicas (sgRNA) elimina y reemplaza la secuencia objetivo y vincula un gen informador codificado genéticamente. La utilidad de este enfoque se demuestra mediante la descripción de mediciones fenotípicas no invasivas de la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra de tipo salvaje y editadas genéticamente. Este enfoque permite el estudio eficiente de las variantes asociadas a la enfermedad en un organismo completo. Además, esta estrategia ofrece posibilidades para la inserción de secuencias exógenas de elección, como genes reporteros, ortólogos o editores de genes.
Introduction
Las estrategias de edición de genes basadas en CRISPR en modelos animales permiten el estudio de enfermedades genéticamente hereditarias, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el organismo 1,2,3. El pez cebra proporciona un modelo poderoso que está más cerca en numerosos aspectos fisiológicos de los humanos que los modelos celulares murinos o derivados de humanos4. Se ha utilizado una amplia gama de herramientas y estrategias genéticas en el pez cebra tanto para el cribado genético hacia adelante5 como para el inverso6. El mapeo genético integral y la anotación en el pez cebra han facilitado los enfoques de edición de genes como una técnica primaria para diseñar knockouts de genes dirigidos (KO) y knock-ins precisos (KI)7.
A pesar de esto, la generación de ediciones precisas de KI en el pez cebra está limitada por las bajas eficiencias y la dificultad de una detección precisa. Aunque las nucleasas efectoras similares a factores de transcripción (TALEN) se han utilizado y optimizado con éxito para KI8, CRISPR proporciona una estrategia mejorada de edición de genes con una orientación más simple de sgRNA. Numerosos estudios han utilizado CRISPR para generar KI precisos en peces cebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, aunque estas ediciones generadas a través de la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR (HDR) tienden a ser ineficientes con bajo éxito intrínseco tasas que requieren genotipado como cribado primario 9,10,14,21. Esto demuestra la necesidad de un sistema KI CRISPR eficiente en el pez cebra, así como un sistema confiable de alto rendimiento para detectar ediciones precisas.
El objetivo de este estudio fue describir una plataforma para generar un gen cardíaco preciso KI en corazones de pez cebra con detección simple y de alto rendimiento de ediciones exitosas. Se describe un enfoque de reemplazo de exón de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9, que se basa en un enfoque TALEN8. Este enfoque implica la escisión de la secuencia diana utilizando guías de dos sgRNA y el reemplazo con una secuencia plantilla exógena que contiene el KI de interés, así como un gen informador intrónico codificado genéticamente (Figura 1). La integración de un reportero fluorescente codificado genéticamente dentro de la secuencia intrónica del gen objetivo permite la detección eficiente de ediciones positivas. Luego se describe una plataforma de fenotipado para evaluar la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra para la caracterización no invasiva de las variantes genéticas asociadas con LQTS hereditario, un trastorno eléctrico cardíaco que predispone a los individuos a la muerte súbita cardíaca.
Estos enfoques mejorarán el acceso y el uso de las ediciones del gen KI del pez cebra para modelar enfermedades hereditarias y abordar cuestiones biológicas y fisiológicas, como el mapeo de patrones de expresión génica y la regulación del desarrollo. Dado que los corazones de pez cebra son mejores características electrofisiológicas cardíacas humanas paralelas que los modelos murinos, pueden ser particularmente atractivos como un sistema genéticamente tratable para el modelado de enfermedades cardíacas 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ingeniería de ediciones genéticas precisas utilizando CRISPR-Cas9 se ve desafiada por la baja eficiencia de los mecanismos HDR y su detección eficiente. Aquí, se describe un enfoque de reemplazo de exones de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9 que produce ediciones precisas en peces cebra con detección visual directa de ediciones positivas. La eficacia de este enfoque se demuestra mediante la generación de ediciones precisas en el gen zkcnh6a . Este documento muestra cómo la función cardíaca en larvas de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación de los Institutos Canadienses de Salud (T.W.C.) y las subvenciones de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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