Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri
Summary
Bu protokol, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemelerini kolaylaştırmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Uzun QT Sendromu ile ilişkili bir gen varyantını modellemek için bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için bir fenotipleme boru hattı sunulmuştur.
Abstract
Hayvan modellerinde düzenli olarak kümelenmiş aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR), fizyolojik olayların incelenmesi için kesin genetik manipülasyon sağlar. Zebra balığı, tüm organ ve organizma düzeyinde kalıtsal hastalık, gelişim ve toksikoloji ile ilgili sayısız soruyu incelemek için etkili bir genetik model olarak kullanılmıştır. İyi açıklamalı ve haritalanmış zebra balığı genomu nedeniyle, gen düzenleme için çok sayıda araç geliştirilmiştir. Bununla birlikte, CRISPR kullanarak hassas knock-in düzenlemeleri üretmenin etkinliği ve tespit etme kolaylığı sınırlayıcı bir faktördür. Burada açıklanan, kardiyak repolarizasyondan sorumlu ve elektriksel bozukluk Uzun QT Sendromu (LQTS) ile ilişkili bir gendeki hassas düzenlemelerin basit tespiti ile CRISPR-Cas9 tabanlı bir knock-in yaklaşımıdır. Bu iki tek kılavuzlu RNA (sgRNA) yaklaşımı, hedef diziyi heyecanlandırır ve değiştirir ve genetik olarak kodlanmış bir muhabir genini birbirine bağlar. Bu yaklaşımın yararı, vahşi tip ve gen düzenlenmiş zebra balığı larvalarında kardiyak elektriksel fonksiyonun invaziv olmayan fenotipik ölçümlerini tanımlayarak gösterilmiştir. Bu yaklaşım, bütün bir organizmada hastalıkla ilişkili varyantların verimli bir şekilde çalışılmasını sağlar. Ayrıca, bu strateji, muhabir genleri, ortologlar veya gen editörleri gibi tercih edilen eksojen dizilerin eklenmesi için olanaklar sunar.
Introduction
Hayvan modellerinde CRISPR tabanlı gen düzenleme stratejileri, genetik olarak kalıtsal hastalık, gelişim ve toksikolojinin tüm organizma düzeyindeincelenmesini sağlar 1,2,3. Zebra balığı, insanlara birçok fizyolojik açıdan murin veya insan kaynaklı hücre modellerinden daha yakın olan güçlü bir model sağlar4. Zebra balıklarında hem ileri5 hem de ters genetik tarama6 için kapsamlı bir dizi genetik araç ve strateji kullanılmıştır. Zebra balığındaki kapsamlı genetik haritalama ve ek açıklama, hedeflenen gen nakavtlarını (KO’lar) ve hassas vuruşları (KI’lar)7 tasarlamak için birincil teknik olarak gen düzenleme yaklaşımlarını kolaylaştırmıştır.
Buna rağmen, zebra balıklarında hassas KI düzenlemeleri oluşturmak, düşük verimlilik ve doğru algılamanın zorluğu ile sınırlıdır. Transkripsiyon faktörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN’ler) KI’lar8 için başarıyla kullanılmış ve optimize edilmiş olmasına rağmen, CRISPR daha basit sgRNA hedeflemesi ile gelişmiş bir gen düzenleme stratejisi sağlar. Çok sayıda çalışma, zebra balığı 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20’de hassas KI’lar oluşturmak için CRISPR’yi kullanmıştır, ancak CRISPR aracılı homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla oluşturulan bu düzenlemeler düşük içsel başarı ile verimsiz olma eğilimindedir. birincil ekran olarak genotipleme gerektiren oranlar 9,10,14,21. Bu, zebra balıklarında verimli bir KI CRISPR sistemine ve hassas düzenlemeleri tespit etmek için güvenilir, yüksek verimli bir sisteme duyulan ihtiyacı göstermektedir.
Bu çalışmanın amacı, zebra balığı kalplerinde başarılı düzenlemelerin basit ve yüksek verimli tespiti ile hassas bir kardiyak gen KI oluşturmak için bir platform tanımlamaktı. TALEN yaklaşımı8’e dayanan bir CRISPR-Cas9 tabanlı iki sgRNA ekzon replasman yaklaşımı tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, iki sgRNA kılavuzu kullanılarak hedef dizinin eksizyonunu ve ilgilenilen KI’nın yanı sıra genetik olarak kodlanmış bir intronic muhabir genini içeren eksojen bir şablon dizisi ile değiştirilmesini içerir (Şekil 1). Genetik olarak kodlanmış bir floresan muhabirin hedef gen intronik dizisine entegrasyonu, pozitif düzenlemelerin etkili bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Daha sonra, zebra balığı larvalarında, bireyleri ani kardiyak ölüme yatkın kılan bir kardiyak elektriksel bozukluk olan kalıtsal LQTS ile ilişkili gen varyantlarının non-invaziv karakterizasyonu için kardiyak elektriksel fonksiyonu değerlendirmek için bir fenotipleme platformu tanımlanmıştır.
Bu yaklaşımlar, kalıtsal hastalıkları modellemek ve gen ekspresyon kalıplarının haritalanması ve gelişimsel düzenleme gibi biyolojik ve fizyolojik soruları ele almak için zebra balığı KI gen düzenlemelerine erişimi ve bunların kullanımını artıracaktır. Zebra balığı kalpleri, insan kardiyak elektrofizyolojik özelliklerine murin modellerinden daha iyi paralel olduğundan, kalp hastalığı modellemesiiçin genetik olarak izlenebilir bir sistem olarak özellikle çekici olabilirler 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9 kullanarak hassas gen düzenlemelerinin mühendisliği, HDR mekanizmalarının düşük verimlilikleri ve verimli tespitleri nedeniyle zorlanmaktadır. Burada, zebra balığında pozitif düzenlemelerin doğrudan görsel olarak algılanmasıyla hassas düzenlemeler üreten CRISPR-Cas9 tabanlı iki sgRNA ekzon değiştirme yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu yaklaşımın etkinliği, zkcnh6a geninde kesin düzenlemeler üreterek gösterilmiştir. Bu yazıda, gen düzenlenmiş zebra balığı larvalar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri Proje hibesi (T.W.C.) ve Kanada Keşif hibeleri Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (T.W.C.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
