Una plataforma de vacuna de nanopartículas "plug-and-display" basada en vesículas de membrana externa que muestran el dominio de unión al receptor SARS-CoV-2
Summary
El presente protocolo describe la bioingeniería de vesículas de membrana externa como una plataforma de vacunas “Plug-and-Display”, que incluye producción, purificación, bioconjugación y caracterización.
Abstract
Las nanopartículas biomiméticas obtenidas de bacterias o virus han atraído un interés sustancial en la investigación y el desarrollo de vacunas. Las vesículas de membrana externa (OMV) son secretadas principalmente por bacterias gramnegativas durante el crecimiento promedio, con un diámetro de tamaño nanométrico y actividad autoadyuvante, que puede ser ideal para la administración de vacunas. Los OMV han funcionado como un sistema de administración multifacético de proteínas, ácidos nucleicos y moléculas pequeñas. Para aprovechar al máximo las características biológicas de los OMV, se utilizaron OMV derivados de Escherichia coli de bioingeniería como portador y el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 como antígeno para construir una plataforma de vacuna “Plug-and-Display”. Los dominios SpyCatcher (SC) y SpyTag (ST) en Streptococcus pyogenes se aplicaron para conjugar OMV y RBD. El gen de la citolisina A (ClyA) se tradujo con el gen SC como una proteína de fusión después de la transfección de plásmidos, dejando un sitio reactivo en la superficie de los OMV. Después de mezclar RBD-ST en un sistema tampón convencional durante la noche, se formó una unión covalente entre los OMV y RBD. Por lo tanto, se logró una vacuna OMV de visualización multivalente. Al reemplazarla con diversos antígenos, la plataforma de vacunas OMV puede mostrar de manera eficiente una variedad de antígenos heterogéneos, lo que podría prevenir rápidamente las epidemias de enfermedades infecciosas. Este protocolo describe un método preciso para construir la plataforma de vacunas OMV, incluida la producción, purificación, bioconjugación y caracterización.
Introduction
Como plataforma potencial de vacunación, las vesículas de membrana externa (OMV) han atraído cada vez más atención en los últimos años 1,2. Los OMV, secretados principalmente naturalmente por bacterias gramnegativas3, son partículas esféricas a nanoescala compuestas por una bicapa lipídica, generalmente en el tamaño de 20-300 nm4. Los OMV contienen varios componentes bacterianos parentales, incluidos antígenos bacterianos y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), que sirven como potenciadores inmunes sólidos5. Beneficiándose de sus componentes únicos, estructura natural de vesículas y excelentes sitios de modificación de ingeniería genética, los OMV se han desarrollado para su uso en muchos campos biomédicos, incluidas las vacunas bacterianas6, los adyuvantes7, los medicamentos de inmunoterapia contra el cáncer8, los vectores de administración de medicamentos9 y los adhesivos antibacterianos10.
La pandemia de SARS-CoV-2, que se ha extendido por todo el mundo desde 2020, ha tenido un alto costo en la sociedad mundial. El dominio de unión al receptor (RBD) en la proteína espiga (proteína S) puede unirse con la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2), que luego media la entrada del virus en la célula11,12,13. Por lo tanto, RBD parece ser un objetivo principal para el descubrimiento de vacunas14,15,16. Sin embargo, el RBD monomérico es poco inmunogénico, y su pequeño peso molecular dificulta el reconocimiento del sistema inmunitario, por lo que a menudo se requieren adyuvantes17.
Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de RBD, se construyeron OMV que mostraban RBD polivalentes. Los estudios existentes que utilizan OMV para mostrar RBD generalmente fusionan RBD con OMV para ser expresado en bacterias18. Sin embargo, RBD es una proteína derivada del virus, y es probable que la expresión procariota afecte su actividad. Para resolver este problema, se utilizó el sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, para formar un isopéptido covalente con OMV y RBD en un sistema tampón convencional19. El dominio SC se expresó con citolisina A (ClyA) como una proteína de fusión por Escherichia coli de bioingeniería, y ST se expresó con RBD a través del sistema de expresión celular HEK293F. OMV-SC y RBD-ST se mezclaron e incubaron durante la noche. Después de la purificación por ultracentrifugación o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), SE OBTUVO OMV-RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para crear una plataforma de vacuna de nanopartículas “Plug-and-Display”, ClyA fusionado con SC se expresó en cepas BL21 (DE3), que es uno de los modelos más utilizados para la producción de proteínas recombinantes debido a sus ventajas en la expresión de proteínas24, de modo que habría suficiente fragmento SC en la superficie de los OMV durante el proceso de proliferación de bacterias. Al mismo tiempo, se preparó un antígeno diana fusionado con ST para el acoplamiento químico entre lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) y el Proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31670936, 82041045).
Materials
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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