منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2
Summary
يصف البروتوكول الحالي الهندسة الحيوية للحويصلات الغشائية الخارجية بأنها منصة لقاح “التوصيل والعرض” ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.
Abstract
اجتذبت الجسيمات النانوية المحاكية بيولوجيا التي تم الحصول عليها من البكتيريا أو الفيروسات اهتماما كبيرا بالبحث والتطوير في مجال اللقاحات. تفرز الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) بشكل أساسي بواسطة البكتيريا سالبة الجرام أثناء متوسط النمو ، بقطر نانوي ونشاط مساعد ذاتي ، والذي قد يكون مثاليا لتوصيل اللقاح. عملت OMVs كنظام توصيل متعدد الأوجه للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الصغيرة. للاستفادة الكاملة من الخصائص البيولوجية ل OMVs ، تم استخدام OMVs المشتقة من الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا كحامل ومجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) كمستضد لبناء منصة لقاح “التوصيل والعرض”. تم تطبيق نطاقات SpyCatcher (SC) و SpyTag (ST) في Streptococcus pyogenes على OMVs و RBD المرافقين. تمت ترجمة جين Cytolysin A (ClyA) مع جين SC كبروتين اندماج بعد نقل البلازميد ، تاركا موقعا تفاعليا على سطح OMVs. بعد خلط RBD-ST في نظام عازلة تقليدي بين عشية وضحاها ، تم تشكيل الربط التساهمي بين OMVs و RBD. وهكذا ، تم تحقيق لقاح OMV متعدد التكافؤ. من خلال الاستبدال بمستضدات متنوعة ، يمكن لمنصة لقاح OMVs عرض مجموعة متنوعة من المستضدات غير المتجانسة بكفاءة ، وبالتالي منع أوبئة الأمراض المعدية بسرعة. يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة لبناء منصة لقاح OMV ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.
Introduction
كمنصة لقاح محتملة ، جذبت الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) المزيد والمزيد من الاهتمام في السنوات الأخيرة 1,2. OMVs ، التي تفرزها بشكل طبيعي البكتيريا سالبة الجرام3 ، هي جسيمات نانوية كروية تتكون من طبقة ثنائية دهنية ، عادة بحجم 20-300 نانومتر4. تحتوي OMVs على مكونات بكتيرية أبوية مختلفة ، بما في ذلك المستضدات البكتيرية والأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، والتي تعمل كمحفزات مناعية صلبة5. بالاستفادة من مكوناتها الفريدة ، وهيكل الحويصلة الطبيعية ، ومواقع تعديل الهندسة الوراثية الرائعة ، تم تطوير OMVs للاستخدام في العديد من المجالات الطبية الحيوية ، بما في ذلك اللقاحات البكتيرية6 ، والمواد المساعدة7 ، وأدوية العلاج المناعي للسرطان8 ، ونواقل توصيل الدواء9 ، والمواد اللاصقة المضادة للبكتيريا10.
تسبب جائحة SARS-CoV-2 ، الذي انتشر في جميع أنحاء العالم منذ عام 2020 ، في خسائر فادحة في المجتمع العالمي. يمكن أن يرتبط مجال ربط المستقبلات (RBD) في بروتين سبايك (بروتين S) بالإنزيم المحول للأنجيوتنسين البشري 2 (ACE2) ، والذي يتوسط بعد ذلك دخول الفيروس إلى الخلية11،12،13. وبالتالي ، يبدو أن RBD هو الهدف الرئيسي لاكتشاف اللقاح14،15،16. ومع ذلك ، فإن RBD الأحادي ضعيف المناعة ، ووزنه الجزيئي الصغير يجعل من الصعب على الجهاز المناعي التعرف عليه ، لذلك غالبا ما تكون المواد المساعدة مطلوبة17.
من أجل زيادة مناعة RBD ، تم إنشاء OMVs التي تعرض RBDs متعددة التكافؤ. عادة ما تدمج الدراسات الحالية التي تستخدم OMV لعرض RBD RBD مع OMV ليتم التعبير عنها في البكتيريا18. ومع ذلك ، فإن RBD هو بروتين مشتق من الفيروس ، ومن المرجح أن يؤثر التعبير بدائي النواة على نشاطه. لحل هذه المشكلة ، تم استخدام نظام SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) ، المشتق من Streptococcus pyogenes ، لتشكيل إيزوببتيد تساهمي مع OMV و RBD في نظام عازلة تقليدي19. تم التعبير عن مجال SC مع Cytolysin A (ClyA) كبروتين اندماج بواسطة الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا ، وتم التعبير عن ST باستخدام RBD عبر نظام التعبير الخلوي HEK293F. تم خلط OMV-SC و RBD-ST وحضنهما بين عشية وضحاها. بعد التنقية عن طريق الطرد المركزي الفائق أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، تم الحصول على OMV-RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
لإنشاء منصة لقاح الجسيمات النانوية “التوصيل والعرض” ، تم التعبير عن ClyA المنصهر SC في سلالات BL21 (DE3) ، والتي تعد واحدة من أكثر النماذج استخداما لإنتاج البروتين المؤتلف بسبب مزاياها في التعبير البروتيني24 ، بحيث يكون هناك ما يكفي من شظايا SC المعروضة على سطح OMVs أثناء عملية انتشار ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الرئيسي لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ومشروع المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31670936، 82041045).
Materials
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems – Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
