सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन प्रदर्शित करने वाले बाहरी झिल्ली पुटिकाओं पर आधारित एक "प्लग-एंड-डिस्प्ले" नैनोपार्टिकल वैक्सीन प्लेटफॉर्म
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं के बायोइंजीनियरिंग को “प्लग-एंड-डिस्प्ले” वैक्सीन प्लेटफॉर्म के रूप में वर्णित करता है, जिसमें उत्पादन, शुद्धिकरण, बायोकोन्जेशन और लक्षण वर्णन शामिल हैं।
Abstract
बैक्टीरिया या वायरस से प्राप्त बायोमिमेटिक नैनोकणों ने वैक्सीन अनुसंधान और विकास में पर्याप्त रुचि आकर्षित की है। बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (ओएमवी) को मुख्य रूप से औसत विकास के दौरान ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा स्रावित किया जाता है, जिसमें नैनो-आकार का व्यास और स्व-सहायक गतिविधि होती है, जो वैक्सीन वितरण के लिए आदर्श हो सकती है। ओएमवी ने प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और छोटे अणुओं के लिए एक बहुआयामी वितरण प्रणाली के रूप में कार्य किया है। ओएमवी की जैविक विशेषताओं का पूरा लाभ उठाने के लिए, बायोइंजीनियर्ड एस्चेरिचिया कोलाई-व्युत्पन्न ओएमवी का उपयोग वाहक के रूप में और सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) को एंटीजन के रूप में “प्लग-एंड-डिस्प्ले” वैक्सीन प्लेटफॉर्म बनाने के लिए किया गया था। स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस में स्पाईकैचर (एससी) और स्पायटैग (एसटी) डोमेन संयुग्मित ओएमवी और आरबीडी के लिए लागू किए गए थे। साइटोलिसिन ए (क्लाया) जीन को एससी जीन के साथ प्लास्मिड अभिकर्मक के बाद एक संलयन प्रोटीन के रूप में अनुवादित किया गया था, जिससे ओएमवी की सतह पर एक प्रतिक्रियाशील साइट बच गई थी। रात भर एक पारंपरिक बफर सिस्टम में आरबीडी-एसटी को मिलाने के बाद, ओएमवी और आरबीडी के बीच सहसंयोजक बंधन का गठन किया गया था। इस प्रकार, एक मल्टीवेलेंट-डिस्प्लेिंग ओएमवी वैक्सीन हासिल की गई थी। विभिन्न एंटीजन के साथ प्रतिस्थापित करके, ओएमवी वैक्सीन प्लेटफॉर्म कुशलतापूर्वक विभिन्न विषम एंटीजन प्रदर्शित कर सकता है, जिससे संभावित रूप से संक्रामक रोग महामारियों को तेजी से रोका जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ओएमवी वैक्सीन प्लेटफॉर्म के निर्माण के लिए एक सटीक विधि का वर्णन करता है, जिसमें उत्पादन, शुद्धिकरण, बायोकोन्जेशन और लक्षण वर्णन शामिल हैं।
Introduction
एक संभावित वैक्सीन प्लेटफॉर्म के रूप में, बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (ओएमवी) ने हालके वर्षों में अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित किया है। ओएमवी, मुख्य रूप से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया3 द्वारा स्वाभाविक रूप से स्रावित होते हैं, गोलाकार नैनोस्केल कण होते हैं जो लिपिड बाइलेयर से बने होते हैं, आमतौर पर 20-300 एनएम4 के आकार में। ओएमवी में विभिन्न पैतृक जीवाणु घटक होते हैं, जिनमें जीवाणु एंटीजन और रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) शामिल हैं, जो ठोस प्रतिरक्षा शक्तिकारकके रूप में काम करते हैं। अपने अद्वितीय घटकों, प्राकृतिक पुटिका संरचना और महान आनुवंशिक इंजीनियरिंग संशोधन साइटों से लाभान्वित होकर, ओएमवी को कई बायोमेडिकल क्षेत्रों में उपयोग के लिए विकसित किया गया है, जिसमें बैक्टीरियल वैक्सीन6, एडजुवेंट7, कैंसर इम्यूनोथेरेपी ड्रग्स8, ड्रग डिलीवरी वैक्टर9 और एंटी-बैक्टीरियल चिपकने वाला10 शामिल हैं।
सार्स-सीओवी-2 महामारी, जो 2020 से दुनिया भर में फैली है, ने वैश्विक समाज पर भारी असर डाला है। स्पाइक प्रोटीन (एस प्रोटीन) में रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एसीई 2) के साथ बंध सकता है, जो तब सेल11,12,13 में वायरस के प्रवेश की मध्यस्थता करता है। इस प्रकार, आरबीडी वैक्सीन की खोज के लिए एक प्रमुख लक्ष्य प्रतीत होता है 14,15,16। हालांकि, मोनोमेरिक आरबीडी खराब इम्युनोजेनिक है, और इसका छोटा आणविक भार प्रतिरक्षा प्रणाली को पहचानना मुश्किल बनाता है, इसलिए सहायक दवाओं की अक्सर आवश्यकता होतीहै।
आरबीडी की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने के लिए, पॉलीवेलेंट आरबीडी प्रदर्शित करने वाले ओएमवी का निर्माण किया गया था। आरबीडी प्रदर्शित करने के लिए ओएमवी का उपयोग करने वाले मौजूदा अध्ययन आमतौर पर बैक्टीरिया18 में व्यक्त किए जाने वाले ओएमवी के साथ आरबीडी को फ्यूज करते हैं। हालांकि, आरबीडी एक वायरस-व्युत्पन्न प्रोटीन है, और प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति इसकी गतिविधि को प्रभावित करने की संभावना है। इस समस्या को हल करने के लिए, स्पाइटैग (एसटी)/स्पाईकैचर (एससी) प्रणाली, जो स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस से प्राप्त होती है, का उपयोग पारंपरिक बफर सिस्टम19 में ओएमवी और आरबीडी के साथ सहसंयोजक आइसोपेप्टाइड बनाने के लिए किया गया था। एससी डोमेन को साइटोलिसिन ए (क्लायए) के साथ बायोइंजीनियर्ड एस्चेरिचिया कोलाई द्वारा एक संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया था, और एसटी को एचईके 293 एफ सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से आरबीडी के साथ व्यक्त किया गया था। ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी को रात भर मिलाया गया और इनक्यूबेट किया गया। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन या आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्धिकरण के बाद, ओएमवी-आरबीडी प्राप्त किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
“प्लग-एंड-डिस्प्ले” नैनोपार्टिकल वैक्सीन प्लेटफॉर्म बनाने के लिए, एससी-फ्यूज्ड क्लाया को बीएल 21 (डीई 3) उपभेदों में व्यक्त किया गया था, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति24 में इसके फायदों के कारण पुनः संयोजक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चोंगकिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के प्रमुख कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (सं। सीएसटीसी 2020jcyj-zdxmX0027) और चीनी राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन परियोजना (संख्या 31670936, 82041045)।
Materials
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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