Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

Summary

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina “Plug-and-Display”, incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Abstract

Nanopartículas biomiméticas obtidas de bactérias ou vírus têm atraído um interesse substancial na pesquisa e desenvolvimento de vacinas. As vesículas da membrana externa (OMVs) são secretadas principalmente por bactérias gram-negativas durante o crescimento médio, com um diâmetro nanométrico e atividade auto-adjuvante, o que pode ser ideal para a administração da vacina. Os OMVs têm funcionado como um sistema de entrega multifacetado para proteínas, ácidos nucleicos e pequenas moléculas. Para aproveitar ao máximo as características biológicas das OMVs, as OMVs derivadas de Escherichia coli de bioengenharia foram utilizadas como transportadoras e o domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 como antígeno para construir uma plataforma de vacina “Plug-and-Display”. Os domínios SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) em Streptococcus pyogenes foram aplicados para conjugar OMVs e RBD. O gene da citolisina A (ClyA) foi traduzido com o gene SC como uma proteína de fusão após a transfecção do plasmídeo, deixando um sítio reativo na superfície das OMVs. Após a mistura do RBD-ST em um sistema tampão convencional durante a noite, formou-se ligação covalente entre as OMVs e o RBD. Assim, uma vacina OMV multivalente exibindo foi alcançada. Ao substituir por diversos antígenos, a plataforma de vacina OMVs pode exibir eficientemente uma variedade de antígenos heterogêneos, prevenindo assim potencialmente rapidamente epidemias de doenças infecciosas. Este protocolo descreve um método preciso para a construção da plataforma de vacina OMV, incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Introduction

Como potencial plataforma vacinal, as vesículas de membrana externa (OMVs) têm atraído cada vez mais atenção nos últimos anos ^1,2. As OMVs, principalmente secretadas naturalmente por bactérias gram-negativas³, são partículas esféricas em nanoescala compostas por uma bicamada lipídica, geralmente no tamanho de 20-300 nm⁴. As OMVs contêm vários componentes bacterianos parentais, incluindo antígenos bacterianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), que servem como potencializadores imunológicos sólidos⁵. Beneficiando-se de seus componentes únicos, estrutura natural da vesícula e ótimos locais de modificação de engenharia genética, os OMVs foram desenvolvidos para uso em muitos campos biomédicos, incluindo vacinas bacterianas⁶, adjuvantes⁷, medicamentos de imunoterapia contra o câncer⁸, vetores de entrega de medicamentos⁹ e adesivos antibacterianos¹⁰.

A pandemia de SARS-CoV-2, que se espalhou por todo o mundo desde 2020, teve um pesado impacto na sociedade global. O domínio de ligação ao receptor (RBD) na proteína spike (proteína S) pode se ligar à enzima conversora de angiotensina humana 2 (ACE2), que então medeia a entrada do vírus na célula^11,12,13. Assim, o RBD parece ser um alvo principal para a descoberta da vacina^14,15,16. No entanto, o RBD monomérico é pouco imunogênico, e seu pequeno peso molecular dificulta o reconhecimento do sistema imunológico, de modo que os adjuvantes são frequentemente necessários¹⁷.

A fim de aumentar a imunogenicidade dos RBD, foram construídas OMVs exibindo RBDs polivalentes. Estudos existentes que utilizam a VMO para exibir a RBD geralmente fundem a RBD com a OMV para serem expressas em bactérias¹⁸. No entanto, o RBD é uma proteína derivada do vírus, e a expressão procariótica provavelmente afetará sua atividade. Para resolver esse problema, o sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, foi utilizado para formar um isopeptídeo covalente com OMV e RBD em um sistema tampão convencional¹⁹. O domínio SC foi expresso com Citolisina A (ClyA) como proteína de fusão por bioengenharia de Escherichia coli, e ST foi expresso com RBD através do sistema de expressão celular HEK293F. OMV-SC e RBD-ST foram misturadas e incubadas durante a noite. Após purificação por ultracentrifugação ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), OBTEVE-SE OMV-RBD.

Protocol

1. Construção do plasmídeo Inserir a sequência SpyCatcher codificadora de DNA (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pThioHisA-ClyA resistente à ampicilina (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e Sal I para construir o plasmídeo pThioHisA ClyA-SC seguindo um relatóriopublicado anteriormente 20. Ligue o gene de fusão sintetizado SpyTag-RBD-Histag (Arquivo Suplementar 1) em um plasm…

Representative Results

O fluxograma desse protocolo é mostrado na Figura 1. Este protocolo poderia ser uma abordagem geral para a utilização de OMVs como uma plataforma de vacinas; basta escolher os sistemas de expressão apropriados com base no tipo de antígenos. A Figura 2 fornece um esquema de projeto de plasmídeos viável. O gene SC está conectado com o gene ClyA através de um ligador flexível, enquanto ST se conecta ao terminal 5′ do gene RBD c…

Discussion

Para criar uma plataforma de vacina de nanopartículas “Plug-and-Display”, a ClyA fundida por SC foi expressa em cepas BL21(DE3), que é um dos modelos mais utilizados para a produção de proteínas recombinantes devido às suas vantagens na expressão proteica²⁴, de modo que haveria fragmento de SC suficiente exibido na superfície das OMVs durante o processo de proliferação de bactérias. Ao mesmo tempo, um antígeno-alvo fundido ST foi preparado para o acoplamento químico entre os antígeno…

Materials

Ampicillin sodium	Sangon Biotech	A610028
Automated cell counter	Countstar	BioTech
BCA protein quantification Kit	cwbio	cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System	Bio-rad
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus	Cavoy	Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer	Sangon Biotech	C520009
Goat pAb to mouse IgG1	Abcam	ab97240
High speed freezing centrifuge	Bioridge	H2500R
His-Tag mouse mAb	Cell signaling technology	2366s
Imidazole	Sangon Biotech	A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen	70691
Non-fat powdered milk	Sangon Biotech	A600669
OPM-293 cell culture medium	Opm biosciences	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid	Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polyethylenimine Linear	Polysciences	23966-1
Prestained protein ladder	Thermo	26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid	Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes	Roche	03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)	GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Beyotime	P0015
Sodium chloride	Sangon Biotech	A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)	Thermo	34577
Suspension instrument	Life Technology	Hula Mixer
Transmission Electron Microscope	Hitachi	HT7800
Tryptone	Oxoid	LP0042B
Ultracentrifuge	Beckman coulter	XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900
Yeast extract	Sangon Biotech	A610961