JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

En "plug-and-display" nanopartikelvaccinplattform baserad på yttre membranblåsor som visar SARS-CoV-2-receptorbindande domän

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/64213
, , , , , ,
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy,Third Military Medical University

Summary

Detta protokoll beskriver biotekniken av yttre membranblåsor som en “Plug-and-Display” -vaccinplattform, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.

Abstract

Biomimetiska nanopartiklar från bakterier eller virus har väckt stort intresse för forskning och utveckling av vaccin. Yttre membranblåsor (OMV) utsöndras huvudsakligen av gramnegativa bakterier under genomsnittlig tillväxt, med en diameter i nanostorlek och självadjuvansaktivitet, vilket kan vara idealiskt för vaccinleverans. OMV har fungerat som ett mångfacetterat leveranssystem för proteiner, nukleinsyror och små molekyler. För att dra full nytta av de biologiska egenskaperna hos OMV användes biotekniska Escherichia coli-härledda OMV som bärare och SARS-CoV-2-receptorbindande domän (RBD) som ett antigen för att konstruera en “Plug-and-Display” -vaccinplattform. Domänerna SpyCatcher (SC) och SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes användes för att konjugera OMV och RBD. Cytolysin A (ClyA) -genen översattes med SC-genen som ett fusionsprotein efter plasmidtransfektion och lämnade ett reaktivt ställe på ytan av OMV: erna. Efter blandning av RBD-ST i ett konventionellt buffertsystem över natten bildades kovalent bindning mellan OMV och RBD. Således uppnåddes ett multivalent visande OMV-vaccin. Genom att ersätta med olika antigener kan OMV-vaccinplattformen effektivt visa en mängd heterogena antigener och därigenom potentiellt snabbt förhindra infektionssjukdomsepidemier. Detta protokoll beskriver en exakt metod för att konstruera OMV-vaccinplattformen, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.

Introduction

Som en potentiell vaccinplattform har yttre membranblåsor (OMV) väckt mer och mer uppmärksamhet de senaste åren 1,2. OMV, som huvudsakligen utsöndras naturligt av gramnegativa bakterier3, är sfäriska partiklar i nanoskala som består av ett lipid-dubbelskikt, vanligtvis i storleken 20-300 nm4. OMV innehåller olika bakteriella komponenter från föräldrar, inklusive bakteriella antigener och patogenassocierade molekylära mönster (PAMP), som fungerar som fasta immunpotentiatorer5. Genom att dra nytta av deras unika komponenter, naturliga vesikelstruktur och fantastiska gentekniska modifieringsställen har OMV utvecklats för användning inom många biomedicinska områden, inklusive bakterievacciner6, adjuvanser7, cancerimmunterapiläkemedel8, läkemedelsleveransvektorer9 och antibakteriella lim10.

SARS-CoV-2-pandemin, som har spridit sig över hela världen sedan 2020, har tagit hårt på det globala samhället. Den receptorbindande domänen (RBD) i spikprotein (S-protein) kan binda med humant angiotensinkonverterande enzym 2 (ACE2), som sedan förmedlar virusets inträde i cellen11,12,13. Således verkar RBD vara ett främsta mål för vaccinupptäckt14,15,16. Monomer RBD är dock dåligt immunogen, och dess lilla molekylvikt gör det svårt för immunsystemet att känna igen, så adjuvanser krävs ofta17.

För att öka immunogeniciteten hos RBD konstruerades OMV som visade polyvalenta RBD: er. Befintliga studier som använder OMV för att visa RBD förenar vanligtvis RBD med OMV för att uttryckas i bakterier18. RBD är emellertid ett virus-härledd protein, och prokaryot uttryck kommer sannolikt att påverka dess aktivitet. För att lösa detta problem användes SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) -systemet, härrörande från Streptococcus pyogenes, för att bilda en kovalent isopeptid med OMV och RBD i ett konventionellt buffertsystem19. SC-domänen uttrycktes med Cytolysin A (ClyA) som ett fusionsprotein av bioengineered Escherichia coli, och ST uttrycktes med RBD via HEK293F cellulärt uttryckssystem. OMV-SC och RBD-ST blandades och inkuberades över natten. Efter rening genom ultracentrifugering eller storleksuteslutningskromatografi (SEC) ERHÖLLS OMV-RBD.

Protocol

1. Plasmid konstruktion Sätt in DNA-kodande SpyCatcher-sekvens (tilläggsfil 1) i en ampicillinresistent pThioHisA-ClyA-plasmid (se materialförteckning) mellan BamH I- och Sal I-platserna för att konstruera plasmiden pThioHisA ClyA-SC efter en tidigare publicerad rapport20. Ligate den syntetiserade SpyTag-RBD-Histag-fusionsgenen (Supplementary File 1) till en pcDNA3.1-plasmid (se materialtab…

Representative Results

Flödesschemat för detta protokoll visas i figur 1. Detta protokoll kan vara ett allmänt tillvägagångssätt för att använda OMV som en vaccinplattform; man behöver bara välja lämpliga uttryckssystem baserat på typen av antigener. Figur 2 ger ett genomförbart plasmiddesignschema. SC-genen är kopplad till ClyA-genen via en flexibel länkare, medan ST ansluter till 5′-terminalen i RBD-genen med en His-tag-gen för rening och …

Discussion

För att skapa en “Plug-and-Display” nanopartikelvaccinplattform uttrycktes SC-smält ClyA i BL21 (DE3) stammar, som är en av de mest använda modellerna för rekombinant proteinproduktion på grund av dess fördelar i proteinuttryck24, så att det skulle finnas tillräckligt med SC-fragment som visas på ytan av OMV: erna under processen med bakteriespridning. Samtidigt framställdes ett ST-smält målantigen för den kemiska kopplingen mellan antigenerna och OMV. Fördelarna med detta experimen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av nyckelprogrammet för Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) och Chinese National Natural Science Foundation Project (nr 31670936, 82041045).

Materials

Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems – Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Tags

Nanoparticle VaccineOuter Membrane VesiclesSARS-CoV-2 Receptor-binding DomainAntigen DisplayCytolysin A SpycatcherOMV Spycatcher ProductionOMV Spycatcher PurificationRBD Spytag TransfectionEukaryotic Expression System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Feng, R., Li, G., Jing, H., Liu, C., Xue, R., Zou, Q., Li, H. A “Plug-And-Display” Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image