JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/64213
, , , , , ,
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy,Third Military Medical University

Summary

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir “Tak ve Göster” aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

Abstract

Bakteri veya virüslerden elde edilen biyomimetik nanopartiküller, aşı araştırma ve geliştirmede büyük ilgi görmüştür. Dış zar vezikülleri (OMV’ler) esas olarak ortalama büyüme sırasında gram-negatif bakteriler tarafından salgılanır, nano boyutlu bir çap ve kendi kendine adjuvan aktivite ile aşı dağıtımı için ideal olabilir. OMV’ler proteinler, nükleik asitler ve küçük moleküller için çok yönlü bir dağıtım sistemi olarak işlev görmüştür. OMV’lerin biyolojik özelliklerinden tam olarak yararlanmak için, biyomühendislik ürünü Escherichia coli türevi OMV’ler bir taşıyıcı olarak ve SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanı (RBD) bir “Tak ve Görüntüle” aşı platformu oluşturmak için bir antijen olarak kullanılmıştır. Streptococcus pyogenes’teki SpyCatcher (SC) ve SpyTag (ST) alanları, OMV’leri ve RBD’yi konjuge etmek için uygulandı. Sitolisin A (ClyA) geni, plazmid transfeksiyonundan sonra SC geni ile bir füzyon proteini olarak çevrildi ve OMV’lerin yüzeyinde reaktif bir bölge bıraktı. RBD-ST’yi gece boyunca geleneksel bir tampon sisteminde karıştırdıktan sonra, OMV’ler ve RBD arasında kovalent bağlanma oluştu. Böylece çok değerli gösteren bir OMV aşısı elde edildi. OMV’lerin aşı platformu, çeşitli antijenlerle değiştirilerek, çeşitli heterojenleri verimli bir şekilde görüntüleyebilir ve böylece bulaşıcı hastalık salgınlarını potansiyel olarak hızlı bir şekilde önleyebilir. Bu protokol, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere OMV aşı platformunu oluşturmak için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Introduction

Potansiyel bir aşı platformu olarak, dış zar vezikülleri (OMV’ler) son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir 1,2. Esas olarak gram-negatif bakteri3 tarafından doğal olarak salgılanan OMV’ler, genellikle 20-300 nm4 boyutunda bir lipit çift katmanından oluşan küresel nano ölçekli parçacıklardır. OMV’ler, katı immün güçlendiriciler olarak hizmet veren bakteriyel antijenler ve patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP’ler) dahil olmak üzere çeşitli ebeveyn bakteriyel bileşenleri içerir5. Eşsiz bileşenlerinden, doğal vezikül yapısından ve büyük genetik mühendisliği modifikasyon alanlarından yararlanan OMV’ler, bakteriyel aşılar6, adjuvanlar7, kanser immünoterapi ilaçları8, ilaç dağıtım vektörleri9 ve anti-bakteriyel yapıştırıcılar10 dahil olmak üzere birçok biyomedikal alanda kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

2020’den bu yana dünya çapında yayılan SARS-CoV-2 salgını, küresel topluma ağır bir zarar verdi. Spike proteinindeki (S proteini) reseptör bağlayıcı alan (RBD), insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) ile bağlanabilir ve bu da virüsünhücre 11,12,13’e girmesine aracılık eder. Bu nedenle, RBD aşı keşfi için birincil hedef gibi görünmektedir14,15,16. Bununla birlikte, monomerik RBD zayıf immünojeniktir ve küçük moleküler ağırlığı bağışıklık sisteminin tanımasını zorlaştırır, bu nedenle adjuvanlara sıklıkla ihtiyaç duyulur17.

RBD’nin immünojenisitesini arttırmak için çok değerli RBD’ler gösteren OMV’ler inşa edildi. RBD’yi görüntülemek için OMV kullanan mevcut çalışmalar genellikle RBD’yi bakteri18’de ifade edilmek üzere OMV ile kaynaştırır. Bununla birlikte, RBD virüs kaynaklı bir proteindir ve prokaryotik ekspresyonun aktivitesini etkilemesi muhtemeldir. Bu sorunu çözmek için, Streptococcus pyogenes’ten türetilen SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) sistemi, geleneksel bir tampon sisteminde OMV ve RBD ile kovalent bir izopeptit oluşturmak için kullanıldı19. SC alanı, biyomühendislik ürünü Escherichia coli tarafından bir füzyon proteini olarak Cytolysin A (ClyA) ile eksprese edildi ve ST, HEK293F hücresel ekspresyon sistemi aracılığıyla RBD ile eksprese edildi. OMV-SC ve RBD-ST gece boyunca karıştırıldı ve inkübe edildi. Ultrasantrifüjleme veya boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırmadan sonra OPV-RBD elde edildi.

Protocol

1. Plazmid yapımı Daha önce yayınlanan bir rapor20’yi takiben plazmid pThioHisA ClyA-SC’yi oluşturmak için BamH I ve Sal I bölgeleri arasındaki ampisilin dirençli bir pThioHisA-ClyA plazmidine DNA kodlama SpyCatcher dizisini (Ek Dosya 1) yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Sentezlenmiş SpyTag-RBD-Histag füzyon genini (Ek Dosya 1), daha önce yayınlanmış bir rapor…

Representative Results

Bu protokolün akış şeması Şekil 1’de gösterilmiştir. Bu protokol, OMV’leri bir aşı platformu olarak kullanmaya yönelik genel bir yaklaşım olabilir; sadece antijenlerin tipine göre uygun ekspresyon sistemlerini seçmek gerekir. Şekil 2, uygulanabilir bir plazmid tasarım şeması sağlar. SC geni, esnek bir bağlayıcı aracılığıyla ClyA genine bağlanırken, ST, saflaştırma ve doğrulama için RBD geninin 5′ termi…

Discussion

Bir “Tak ve Görüntüle” nanopartikül aşı platformu oluşturmak için, SC-kaynaşmış ClyA, protein ekspresyonu24’teki avantajları nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan modellerden biri olan BL21 (DE3) suşlarında ifade edildi, böylece bakteri çoğalması işlemi sırasında OMV’lerin yüzeyinde yeterli SC fragmanı gösterilecekti. Aynı zamanda, antijenler ve OMV’ler arasındaki kimyasal eşleşme için ST-kaynaşmış bir hedef antijen hazırlandı. Bu den…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı’nın Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir (Hayır. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 31670936, 82041045).

Materials

Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems – Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Tags

Keywords: Nanoparticle VaccineOuter Membrane VesiclesSARS-CoV-2 Receptor-binding DomainAntigen DisplayCytolysin A SpycatcherOMV Spycatcher ProductionOMV Spycatcher PurificationRBD Spytag TransfectionEukaryotic Expression System
check_url/kr/64213?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Feng, R., Li, G., Jing, H., Liu, C., Xue, R., Zou, Q., Li, H. A “Plug-And-Display” Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image