Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels

Summary

Le poisson-zèbre a récemment été exploité comme modèle pour valider les modificateurs potentiels de rayonnement. Le présent protocole décrit les étapes détaillées de l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour des expériences de dépistage basées sur les rayonnements et certaines approches observationnelles pour évaluer l’effet de différents traitements et rayonnements.

Abstract

Le poisson-zèbre est largement utilisé dans plusieurs types de recherche car il est l’un des modèles de vertébrés faciles à entretenir et présente plusieurs caractéristiques d’un système de modèle unique et pratique. Comme les cellules hautement prolifératives sont plus sensibles aux dommages à l’ADN induits par les radiations, les embryons de poisson-zèbre sont un modèle in vivo de première ligne dans la recherche sur les rayonnements. De plus, ce modèle projette l’effet des rayonnements et de différents médicaments dans un court laps de temps, ainsi que les événements biologiques majeurs et les réponses associées. Plusieurs études sur le cancer ont utilisé le poisson-zèbre, et ce protocole est basé sur l’utilisation de modificateurs de rayonnement dans le contexte de la radiothérapie et du cancer. Cette méthode peut être facilement utilisée pour valider les effets de différents médicaments sur les embryons irradiés et témoins (non irradiés), identifiant ainsi les médicaments comme des médicaments radiosensibilisants ou protecteurs. Bien que cette méthodologie soit utilisée dans la plupart des expériences de dépistage de drogues, les détails de l’expérience et l’évaluation de la toxicité avec le contexte de l’exposition aux rayons X sont limités ou seulement brièvement abordés, ce qui la rend difficile à réaliser. Ce protocole aborde cette question et traite de la procédure et de l’évaluation de la toxicité avec une illustration détaillée. La procédure décrit une approche simple pour l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour les études de radiation et le dépistage de médicaments à base de rayonnement avec beaucoup de fiabilité et de reproductibilité.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle animal bien connu qui a été largement utilisé dans la recherche au cours des 3 dernières décennies. C’est un petit poisson d’eau douce facile à élever et à élever dans des conditions de laboratoire. Le poisson-zèbre a été largement utilisé pour diverses études développementales et toxicologiques 1,2,3,4,5,6,7,8. Le poisson-zèbre a une fécondité élevée et une génération embryonnaire courte ; Les embryons sont adaptés au suivi de différents stades de développement, sont visuellement transparents et se prêtent à diverses manipulations génétiques et à des plates-formes de criblage à haut débit 9,10,11,12,13,14. En outre, le poisson-zèbre fournit une imagerie in toto et en direct pour laquelle son processus de développement et les différentes déformations en présence de diverses substances ou facteurs toxiques peuvent être facilement étudiés à l’aide de la microscopie stéréoscopique ou fluorescente 7,15,16.

La radiothérapie est l’un des principaux modes thérapeutiques utilisés dans le traitement du cancer 17,18,19,20,21,22,23,24. Cependant, la radiothérapie du cancer nécessite des radioprotecteurs potentiels pour empêcher les cellules saines normales de mourir tout en tuant les cellules malignes ou pour protéger la santé humaine pendant le traitement impliquant des radiations à haute énergie 25,26,27,28,29. À l’inverse, de puissants radiosensibilisants sont également à l’étude pour augmenter l’efficacité des radiations à tuer les cellules malignes, en particulier dans les thérapies ciblées et de précision^30,31,32,33. Par conséquent, pour valider des radioprotecteurs et des sensibilisateurs puissants, un modèle adapté au criblage de médicaments à semi-haut débit et présentant des effets mesurables des rayonnements est fortement sollicité. Plusieurs modèles disponibles sont utilisés dans les études sur les rayonnements et impliqués dans les expériences de dépistage de drogues. Cependant, les vertébrés supérieurs et même le modèle in vivo le plus couramment utilisé, les souris, ne conviennent pas au criblage de médicaments à grande échelle, car il est long, coûteux et difficile de concevoir de telles expériences de dépistage avec ces modèles. De même, les modèles de culture cellulaire sont idéaux pour les variétés d’expériences de criblage de médicaments à haut débit^34,35. Cependant, les expériences impliquant la culture cellulaire ne sont pas toujours pragmatiques, hautement reproductibles ou fiables, car les cellules en culture peuvent modifier considérablement leur comportement en fonction des conditions de croissance et de la cinétique. De plus, les variétés de types de cellules présentent une sensibilisation différentielle aux rayonnements. Notamment, les systèmes de culture cellulaire 2D et 3D ne représentent pas le scénario de l’organisme entier et, par conséquent, les résultats obtenus peuvent ne pas récapituler le niveau réel de radiotoxicité^36,37. À cet égard, le poisson-zèbre offre plusieurs avantages dans le dépistage de nouveaux radiosensibilisateurs et radioprotecteurs. La facilité de manipulation, la grande taille de la couvée, la courte durée de vie, le développement embryonnaire rapide, la transparence de l’embryon et la petite taille du corps font du poisson-zèbre un modèle approprié pour le dépistage de drogues à grande échelle. En raison des avantages ci-dessus, les expériences peuvent être facilement répétées en peu de temps et l’effet peut être facilement observé sous un microscope à dissection dans des plaques multi-puits. Par conséquent, le poisson-zèbre gagne en popularité dans la recherche sur le dépistage des drogues impliquant des études sur les radiations^38,39.

Le potentiel du poisson-zèbre en tant que modèle authentique pour le criblage des modificateurs de rayonnement a été démontré dans diverses études 40,41,42,43,44,45. L’effet radioprotecteur des modificateurs radio potentiels, tels que la nanoparticule DF1, l’amifostine (WR-2721), les protéines de réparation de l’ADN KU80 et ATM, et les cellules souches hématopoïétiques transplantées, ainsi que les effets des radiosensibilisateurs, tels que le flavopiridol et l’AG1478, dans le modèle du poisson-zèbre ont été rapportés 19,41,42,43,44,45,46 . En utilisant le même système, l’effet radioprotecteur de DF-1 (nanoparticule de fullerène) a été évalué à la fois au niveau systémique et au niveau d’un organe spécifique, et l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour le criblage de radioprotecteurs a également été explorée plus en détail⁴⁷. Récemment, le miel de Kelulut a été signalé comme radioprotecteur dans les embryons de poisson-zèbre et s’est avéré augmenter la survie des embryons et prévenir les dommages spécifiques aux organes, les dommages à l’ADN cellulaire et l’apoptose⁴⁸.

De même, les effets radioprotecteurs des polymères générés par la réaction de Hantzsch ont été vérifiés sur des embryons de poisson-zèbre dans le cadre d’un criblage à haut débit, et la protection a été principalement conférée par la protection des cellules contre les dommages à l’ADN⁴⁹. Dans l’une des études précédentes, la statine lipophile fluvastatine a été trouvée comme radiosensibilisant potentiel en utilisant le modèle du poisson-zèbre avec cette approche⁵⁰. De même, les nanoparticules d’or sont considérées comme un radiosensibilisateur idéal et ont été utilisées dans de nombreuses études^51,52.

Le développement embryonnaire chez le poisson-zèbre implique un clivage dans les 3 premières heures au cours desquelles un zygote unicellulaire se divise pour former 2 cellules, 4 cellules, 8 cellules, 16 cellules, 32 cellules et 64 cellules qui sont facilement identifiées avec un stéréomicroscope. Ensuite, il atteint le stade blastula avec 128 cellules (2,25 h après la fécondation, hpf), où les cellules doublent toutes les 15 minutes et passent par les étapes suivantes : 256 cellules (2,5 hpf), 512 cellules (2,75 hpf) et atteignent 1 000+ cellules en seulement 3 h (Figure 1). À 4 h, l’œuf atteint le stade sphérique, suivi de la formation d’un dôme dans la masse embryonnaire 7,53,54. La gastrulation chez le poisson-zèbre commence à partir de 5,25 hpf⁵⁴, où elle atteint le stade de bouclier. Le bouclier indique clairement le mouvement de convergence rapide des cellules d’un côté de l’anneau germinatif (Figure 1) et constitue une phase proéminente et distincte de la gastrulation des embryons qui peut être facilement identifiée^53,54. Bien que l’exposition aux rayonnements des embryons puisse se faire à n’importe quel stade de leur développement, l’exposition aux rayonnements pendant la gastrulation pourrait avoir des changements morphologiques plus distincts, ce qui faciliterait une meilleure lecture des toxicités induites par les rayonnements⁵⁵ ; De même, l’administration de médicaments aux embryons peut être commencée dès 2 HPF⁵⁴.

Protocol

La présente étude a été menée avec l’approbation préalable et en suivant les directives du Comité institutionnel d’éthique animale de l’Institut des sciences de la vie de Bhubaneswar. Tous les travaux d’entretien et d’élevage des poissons-zèbres ont été effectués dans une installation piscicole ambiante à 28,5 °C, et les embryons ont été maintenus dans un incubateur à demande biologique en oxygène (DBO) à une température de 28,5 °C. Ici, la souche AB du poisson-zèbre a été utilisée, e…

Representative Results

La présentation générale du protocole est illustrée à la figure 2. L’effet du rayonnement et la caractérisation en fonction de la dose ont été évalués à l’aide des analyses suivantes. Évaluation des toxicités induites par les rayons XÀ l’aide d’un stéréomicroscope, les anomalies suivantes ont été évaluées et caractérisées après le traitement médicamenteux et/ou la radiothérapie. Conformément …

Discussion

Les poissons-zèbres sont utilisés comme modèles précieux dans de nombreuses études, y compris plusieurs types de recherche sur le cancer. Ce modèle fournit une plate-forme utile pour le dépistage de drogues à grande échelle^67,68. Comme toute autre méthode d’évaluation de la toxicité, l’évaluation quantitative des changements biologiques majeurs lors d’une radiothérapie et/ou d’un traitement médicamenteux est la partie la plus cruciale de ce…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL