Zebravislarven als model om potentiële radiosensibilisatoren of beschermers te evalueren

Summary

De zebravis is onlangs gebruikt als model om potentiële stralingsmodificatoren te valideren. Het huidige protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo’s te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om het effect van verschillende behandelingen en bestraling te evalueren.

Abstract

Zebravissen worden op grote schaal gebruikt in verschillende soorten onderzoek omdat ze een van de gemakkelijk te onderhouden gewervelde modellen zijn en verschillende kenmerken vertonen van een uniek en handig modelsysteem. Omdat zeer proliferatieve cellen gevoeliger zijn voor door straling geïnduceerde DNA-schade, zijn zebravisembryo’s een eerstelijns in vivo model in stralingsonderzoek. Bovendien projecteert dit model het effect van straling en verschillende medicijnen binnen een korte tijd, samen met belangrijke biologische gebeurtenissen en bijbehorende reacties. Verschillende kankerstudies hebben zebravissen gebruikt en dit protocol is gebaseerd op het gebruik van stralingsmodificatoren in de context van radiotherapie en kanker. Deze methode kan gemakkelijk worden gebruikt om de effecten van verschillende geneesmiddelen op bestraalde en controlerende (niet-bestraalde) embryo’s te valideren, waardoor geneesmiddelen worden geïdentificeerd als radiosensibiliserende of beschermende geneesmiddelen. Hoewel deze methodologie wordt gebruikt in de meeste experimenten met het screenen van geneesmiddelen, zijn de details van het experiment en de toxiciteitsbeoordeling met de achtergrond van blootstelling aan röntgenstraling beperkt of slechts kort behandeld, waardoor het moeilijk uit te voeren is. Dit protocol behandelt dit probleem en bespreekt de procedure en toxiciteitsevaluatie met een gedetailleerde illustratie. De procedure beschrijft een eenvoudige aanpak voor het gebruik van zebravisembryo’s voor bestralingsstudies en op straling gebaseerde screening van geneesmiddelen met veel betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid.

Introduction

De zebravis (Danio rerio) is een bekend diermodel dat de afgelopen 3 decennia veel is gebruikt in onderzoek. Het is een kleine zoetwatervis die gemakkelijk te kweken en te kweken is onder laboratoriumomstandigheden. De zebravis is veelvuldig gebruikt voor diverse ontwikkelings- en toxicologische studies 1,2,3,4,5,6,7,8. De zebravis heeft een hoge vruchtbaarheid en een korte embryonale generatie; De embryo’s zijn geschikt voor het volgen van verschillende ontwikkelingsstadia, zijn visueel transparant en zijn vatbaar voor variëteiten van genetische manipulatie en high-throughput screeningplatforms 9,10,11,12,13,14. Bovendien biedt de zebravis in toto en live beeldvorming waarvoor zijn ontwikkelingsproces en verschillende misvormingen in aanwezigheid van verschillende toxische stoffen of factoren gemakkelijk kunnen worden bestudeerd met behulp van stereo- of fluorescentiemicroscopie 7,15,16.

Radiotherapie is een van de belangrijkste therapeutische modi die worden gebruikt bij de behandeling van kanker 17,18,19,20,21,22,23,24. Radiotherapie bij kanker vereist echter potentiële radioprotectors om normale gezonde cellen te beschermen tegen afsterven terwijl kwaadaardige cellen worden gedood of om de menselijke gezondheid te beschermen tijdens therapie met hoogenergetische stralingen 25,26,27,28,29. Omgekeerd worden ook krachtige radiosensibilisatoren onderzocht om de efficiëntie van straling te verhogen om kwaadaardige cellen te doden, vooral bij gerichte en precisietherapieën^30,31,32,33. Daarom is er veel vraag naar een model dat geschikt is voor het screenen van geneesmiddelen met een semi-hoge doorvoer en het meetbaar vertonen van stralingseffecten, om krachtige radioprotectors en sensibilisatoren te valideren. Verschillende beschikbare modellen worden gebruikt in stralingsstudies en zijn betrokken bij experimenten met het screenen van geneesmiddelen. Hogere gewervelde dieren en zelfs het meest gebruikte in vivo model, muizen, zijn echter niet geschikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen, omdat het tijdrovend, kostbaar en uitdagend is om dergelijke screeningsexperimenten met deze modellen te ontwerpen. Evenzo zijn celkweekmodellen ideaal voor variëteiten van high-throughput drug screening experimenten^34,35. Experimenten met celkweek zijn echter niet altijd pragmatisch, zeer reproduceerbaar of betrouwbaar, aangezien cellen in kweek hun gedrag aanzienlijk kunnen veranderen afhankelijk van de groeiomstandigheden en kinetiek. Ook vertonen variëteiten van celtypen differentiële stralingssensibilisatie. Met name 2D- en 3D-celkweeksystemen vertegenwoordigen niet het hele organismescenario, en daarom is het mogelijk dat de verkregen resultaten het werkelijke niveau van radiotoxiciteit niet samenvatten^36,37. In dit opzicht biedt de zebravis verschillende voordelen bij het screenen op nieuwe radiosensibilisatoren en radioprotectors. Het gebruiksgemak, de grote koppelingsgrootte, de korte levensduur, de snelle embryonale ontwikkeling, de transparantie van het embryo en de kleine lichaamsgrootte maken de zebravis tot een geschikt model voor grootschalige screening van geneesmiddelen. Vanwege de bovenstaande voordelen kunnen experimenten gemakkelijk in korte tijd worden herhaald en kan het effect gemakkelijk worden waargenomen onder een ontleedmicroscoop in platen met meerdere putten. Vandaar dat de zebravis aan populariteit wint in onderzoek naar geneesmiddelenscreening met stralingsstudies^38,39.

Het potentieel van zebravissen als bonafide model om stralingsmodificatoren te screenen is aangetoond in verschillende studies 40,41,42,43,44,45. Het radioprotectieve effect van potentiële radiomodificatoren, zoals nanodeeltje DF1, amifostine (WR-2721), DNA-reparatie-eiwitten KU80 en ATM, en getransplanteerde hematopoëtische stamcellen, en de effecten van radiosensibilisatoren, zoals flavopiridol en AG1478, in het zebravismodel zijn gerapporteerd 19,41,42,43,44,45,46 . Met behulp van hetzelfde systeem werd het radioprotectieve effect van DF-1 (fullereen nanodeeltje) zowel op systemisch als op orgaanspecifiek niveau beoordeeld, en ook het gebruik van zebravisembryo’s voor screening van radioprotectoren werd verder onderzocht⁴⁷. Onlangs werd de Kelulut-honing gerapporteerd als een radioprotector in zebravisembryo’s en bleek de overleving van embryo’s te verhogen en orgaanspecifieke schade, cellulaire DNA-schade en apoptose te voorkomen.

Evenzo werden de radioprotectieve effecten van polymeren die via de reactie van Hantzsch werden gegenereerd, gecontroleerd op zebravisembryo’s in een high-throughput screening, en de bescherming werd voornamelijk verleend door cellen te beschermen tegen DNA-schade⁴⁹. In een van de eerdere studies werd de lipofiele statine fluvastatine gevonden als een potentiële radiosensibilisator met behulp van het zebravismodel met deze benadering⁵⁰. Evenzo worden gouden nanodeeltjes beschouwd als een ideale radiosensibilisator en zijn ze in veel onderzoeken gebruikt^51,52.

De embryonale ontwikkeling bij zebravissen omvat splitsing in de eerste 3 uur waarin een eencellige zygote zich deelt om 2 cellen, 4 cellen, 8 cellen, 16 cellen, 32 cellen en 64 cellen te vormen die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd met een stereomicroscoop. Vervolgens bereikt het het blastula-stadium met 128 cellen (2,25 uur na de bevruchting, hpf), waarbij de cellen elke 15 minuten verdubbelen en de volgende fasen doorlopen: 256 cellen (2,5 hpf), 512 cellen (2,75 hpf) en het bereiken van 1.000+ cellen in slechts 3 uur (Figuur 1). Na 4 uur bereikt het ei het bolstadium, gevolgd door de vorming van een koepelvorm in de embryonale massa 7,53,54. De gastrulatie bij zebravissen begint vanaf 5,25 hpf⁵⁴, waar het het schildstadium bereikt. Het schild geeft duidelijk de snelle convergentiebeweging van de cellen naar één kant van de kiemring aan (Figuur 1) en is een prominente en duidelijke fase van gastrulerende embryo’s die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd^53,54. Hoewel blootstelling aan straling van embryo’s in elk stadium van hun ontwikkeling kan plaatsvinden, kan blootstelling aan straling tijdens gastrulatie meer duidelijke morfologische veranderingen ondergaan die een betere uitlezing van door straling geïnduceerde toxiciteiten mogelijk maken⁵⁵; Evenzo kan de toediening van geneesmiddelen aan embryo’s al vanaf 2 HPF⁵⁴ worden gestart.

Protocol

De huidige studie werd uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van en volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Al het onderhoud en de kweek van zebravissen werden uitgevoerd in een omringende viskweekfaciliteit bij 28,5 °C, en de embryo’s werden bewaard in een incubator voor biologisch zuurstofverbruik (BZV) bij een temperatuur van 28,5 °C. Hier werd de zebravis AB-stam gebruikt en werd de enscenering uitgevoerd volgens Kimmel et a…

Representative Results

De algemene lay-out van het protocol is weergegeven in figuur 2. Het effect van straling en de dosisafhankelijke karakterisering werd geëvalueerd met de volgende analyses. Beoordeling van door röntgenstraling geïnduceerde toxiciteitenMet behulp van een stereomicroscoop werden de volgende afwijkingen beoordeeld en gekarakteriseerd na de medicamenteuze behandeling en/of bestraling. Volgens de OESO-richtlijnen 61 werden voor t…

Discussion

Zebravissen worden gebruikt als waardevolle modellen in veel onderzoeken, waaronder verschillende soorten kankeronderzoek. Dit model biedt een bruikbaar platform voor grootschalige drugsscreening^67,68. Net als elke andere methode voor de evaluatie van de toxiciteit, is de kwantitatieve evaluatie van de belangrijkste biologische veranderingen bij bestraling en/of medicamenteuze behandeling het meest cruciale onderdeel van dit protocol. In dit soort studies mag ove…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL