Личинки данио-рерио как модель для оценки потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов

Summary

Рыбка данио-рерио недавно использовалась в качестве модели для проверки потенциальных модификаторов радиации. В настоящем протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки эффекта различных методов лечения и облучения.

Abstract

Рыбки данио-рерио широко используются в нескольких видах исследований, потому что они являются одной из легко поддерживаемых моделей позвоночных и демонстрируют несколько особенностей уникальной и удобной модельной системы. Поскольку клетки с высокой пролиферативностью более восприимчивы к радиационно-индуцированным повреждениям ДНК, эмбрионы рыбок данио-рерио являются передовой моделью in vivo в радиационных исследованиях. Кроме того, эта модель прогнозирует воздействие радиации и различных лекарств в течение короткого времени, наряду с основными биологическими событиями и связанными с ними реакциями. В нескольких исследованиях рака использовались рыбки данио, и этот протокол основан на использовании модификаторов излучения в контексте лучевой терапии и рака. Этот метод может быть легко использован для проверки воздействия различных лекарств на облученные и контрольные (необлученные) эмбрионы, таким образом, идентифицируя препараты как радиосенсибилизирующие или защитные препараты. Несмотря на то, что эта методология используется в большинстве экспериментов по скринингу лекарственных средств, детали эксперимента и оценка токсичности на фоне рентгеновского излучения ограничены или рассматриваются лишь вскользь, что затрудняет его выполнение. В настоящем протоколе рассматривается этот вопрос и обсуждается процедура и оценка токсичности с подробной иллюстрацией. Процедура описывает простой подход к использованию эмбрионов рыбок данио для лучевых исследований и радиационного скрининга лекарственных препаратов с высокой надежностью и воспроизводимостью.

Introduction

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) – это хорошо известная модель животного, которая широко использовалась в исследованиях в течение последних 3 десятилетий. Это небольшая пресноводная рыбка, которую легко разводить и разводить в лабораторных условиях. Рыбка данио-рерио широко использовалась для различных исследований развития и токсикологических исследований 1,2,3,4,5,6,7,8. Рыбка данио-рерио отличается высокой плодовитостью и коротким эмбриональным образованием; Эмбрионы пригодны для отслеживания различных стадий развития, визуально прозрачны и поддаются различным генетическим манипуляциям и высокопроизводительным скрининговым платформам 9,10,11,12,13,14. Кроме того, рыбка данио-рерио обеспечивает полную и живую визуализацию, для чего процесс ее развития и различные деформации в присутствии различных токсических веществ или факторов могут быть легко изучены с помощью стерео- или флуоресцентной микроскопии 7,15,16.

Лучевая терапия является одним из основных терапевтических режимов, используемых при лечении рака 17,18,19,20,21,22,23,24. Тем не менее, лучевая терапия рака требует потенциальных радиопротекторов для защиты нормальных здоровых клеток от гибели злокачественных клеток или для защиты здоровья человека во время терапии, включающей высокоэнергетические излучения 25,26,27,28,29. С другой стороны, также исследуются мощные радиосенсибилизаторы для повышения эффективности облучения для уничтожения злокачественных клеток, особенно в таргетной и точной терапии^30,31,32,33. Таким образом, для валидации мощных радиопротекторов и сенсибилизаторов настоятельно требуется модель, подходящая для скрининга лекарственных препаратов с полувысокой пропускной способностью и измеримо демонстрирующая радиационные эффекты. Несколько доступных моделей используются в радиационных исследованиях и участвуют в экспериментах по скринингу лекарств. Тем не менее, высшие позвоночные животные и даже мыши, наиболее часто используемые in vivo, не подходят для крупномасштабного скрининга лекарств, потому что разработка таких скрининговых экспериментов с этими моделями отнимает много времени, средств и затрудняет. Аналогичным образом, модели клеточных культур идеально подходят для разновидностей высокопроизводительных экспериментов по скринингу лекарств^34,35. Однако эксперименты с использованием клеточных культур не всегда прагматичны, воспроизводимы или надежны, поскольку клетки в культуре могут заметно изменять свое поведение в зависимости от условий роста и кинетики. Кроме того, разновидности типов клеток демонстрируют дифференциальную радиационную сенсибилизацию. Примечательно, что 2D и 3D системы культивирования клеток не отражают сценарий всего организма, и, таким образом, полученные результаты могут не соответствовать реальному уровню радиотоксичности^36,37. В связи с этим рыбка данио-рерио имеет ряд преимуществ при скрининге на новые радиосенсибилизаторы и радиопротекторы. Простота в обращении, большой размер кладки, короткая продолжительность жизни, быстрое эмбриональное развитие, прозрачность эмбриона и небольшой размер тела делают рыбок данио-рерио подходящей моделью для крупномасштабного скрининга лекарств. Благодаря вышеперечисленным преимуществам, эксперименты можно легко повторить за короткое время, а эффект можно легко наблюдать под препарирующим микроскопом в многолуночных планшетах. Таким образом, рыбка данио-рерио набирает популярность в исследованиях по скринингу наркотиков, включающих радиационные исследования^38,39.

Потенциал рыбок данио-рерио в качестве подлинной модели для скрининга модификаторов излучения был продемонстрирован в различных исследованиях 40,41,42,43,44,45. Сообщалось о радиопротекторном эффекте потенциальных радиомодификаторов, таких как наночастицы DF1, амифостин (WR-2721), белки репарации ДНК KU80 и ATM, а также трансплантированные гемопоэтические стволовые клетки, а также эффекты радиосенсибилизаторов, таких как флавопиридол и AG1478, в модели рыбок данио-рерио ^{19,41,42,43,44,45,46}. С помощью этой же системы оценивали радиопротекторный эффект DF-1 (фуллереновой наночастицы) как на системном, так и на органоспецифическом уровнях, а также дополнительно изучали использование эмбрионов рыбок данио для скрининга радиопротекторов⁴⁷. Недавно сообщалось, что мед Келулут является радиопротектором для эмбрионов рыбок данио, и было обнаружено, что он увеличивает выживаемость эмбрионов и предотвращает органоспецифическое повреждение, повреждение клеточной ДНК и апоптоз⁴⁸.

Аналогичным образом, радиопротекторные эффекты полимеров, полученных в результате реакции Ханча, были проверены на эмбрионах рыбок данио в ходе высокопроизводительного скрининга, и защита была в основном обеспечена защитой клеток^{от повреждения ДНК}. В одном из предыдущих исследований липофильный статин флувастатин был обнаружен в качестве потенциального радиосенсибилизатора с использованием модели рыбок данио-рерио с таким подходом⁵⁰. Точно так же наночастицы золота считаются идеальным радиосенсибилизатором и использовались во многих исследованиях^51,52.

Эмбриональное развитие рыбок данио включает в себя расщепление в первые 3 часа, в течение которых одноклеточная зигота делится на 2 клетки, 4 клетки, 8 клеток, 16 клеток, 32 клетки и 64 клетки, которые легко идентифицировать с помощью стереомикроскопа. Затем он достигает стадии бластулы со 128 клетками (2,25 ч после оплодотворения, hpf), где клетки удваиваются каждые 15 минут и проходят следующие стадии: 256 клеток (2,5 hpf), 512 клеток (2,75 hpf) и достижение 1000+ клеток всего за 3 часа (рис. 1). Через 4 ч яйцо достигает стадии сферы, после чего в зародышевой массе 7,53,54 образуется куполообразная форма. Гаструляция у рыбок данио-рерио начинается с 5,25 hpf⁵⁴, где она достигает стадии щита. Щиток ясно указывает на быстрое конвергентное движение клеток в одну сторону от зародышевого кольца (рис. 1) и является заметной и отчетливой фазой гаструляции эмбрионов, которую можно легко идентифицировать^53,54. Несмотря на то, что радиационное воздействие на эмбрионы может быть осуществлено на любой стадии их развития, радиационное облучение во время гаструляции может иметь более отчетливые морфологические изменения, способствующие лучшему считыванию радиационно-индуцированной токсичности⁵⁵; Аналогичным образом, введение препаратов эмбрионам может быть начато уже с 2 HPF⁵⁴.

Protocol

Настоящее исследование было проведено с предварительного одобрения и в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по этике животных Института наук о жизни, Бхубанешвар. Все содержание и разведение данио-рерио проводилось в помещении для выращивания рыбы при …

Representative Results

Общая компоновка протокола показана на рисунке 2. Влияние радиации и характеристика в зависимости от дозы оценивались с помощью следующих анализов. Оценка токсичности, вызванной рентгеновским излучениемС помощью стереомикроскопа б?…

Discussion

Рыбки данио-рерио используются в качестве ценных моделей во многих исследованиях, в том числе в нескольких видах исследований рака. Эта модель предоставляет полезную платформу для широкомасштабного скрининга на наркотики^67,68. Как и любой другой метод оц?…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL