線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)
Summary
ここに提示するのは、エシェリヒア・コリBL21 Rosetta2のエキソヌクレアーゼVノックアウト株からの細胞抽出物(ΔrecBCDおよびΔrecB)の調製およびバッファー較正のためのプロトコルである。これは、線形DNAテンプレートを使用した無細胞タンパク質合成システムで発現するための迅速、簡単、かつ直接的なアプローチです。
Abstract
無細胞タンパク質合成(CFPS)は、その多くの利点のために、合成生物学の分野で最近非常に人気が高まっています。CFPSにリニアDNAテンプレートを使用すると、クローニング、形質転換、プラスミド抽出のステップを排除することで実験時間を短縮し、技術の可能性を最大限に引き出すことができます。直鎖状DNAはPCRによって迅速かつ容易に増幅して高濃度の鋳型を得ることができ、 潜在的なin vivo 発現毒性を回避します。しかしながら、線状DNAテンプレートは、細胞抽出物中に天然に存在するエキソヌクレアーゼによって急速に分解される。この問題に取り組むために、ヌクレアーゼ阻害剤の追加や、保護のための直鎖状DNA末端の化学修飾など、いくつかの戦略が提案されています。これらの戦略はすべて、余分な時間とリソースを要し、プラスミドに近いレベルのタンパク質発現をまだ取得していません。CFPSに線状DNAテンプレートを使用するための代替戦略の詳細なプロトコルをここに示します。エキソヌクレアーゼ欠損ノックアウト細胞からの細胞抽出物を使用することにより、線状DNAテンプレートは末端修飾を必要とせずにそのまま残ります。我々は、特に直鎖DNAのためのMg-グルタミン酸(Mg-glu)およびK-グルタミン酸(K-glu)のための超音波処理溶解および緩衝液較正による大腸 菌BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 株からの細胞ライセートの調製ステップを提示する。この方法は、 大腸菌 CFPSのプラスミドDNAから得られるタンパク質発現レベルに匹敵するタンパク質発現レベルを達成することができる。
Introduction
無細胞タンパク質合成(CFPS)システムは、バイオセンサーエンジニアリング、分散型製造、および遺伝子回路のプロトタイピングのための高速、簡単、効率的な方法としてますます使用されています1。その大きな可能性から、CFPSシステムは合成生物学の分野で定期的に使用されています。しかし、これまでのところ、CFPSシステムは環状プラスミドに依存しているため、技術がその潜在能力を最大限に発揮できない可能性があります。プラスミドDNAの調製は、クローニング中の多くの時間のかかるステップと大量のDNA単離に依存します。一方、プラスミドまたは合成されたDNAテンプレートからのPCR増幅は、数時間以内にCFPSテンプレートを調製するために使用できます2,3。したがって、線状DNAの適用は、CFPSの有望なソリューションを提供します。しかし、直鎖状DNAは、細胞抽出物4に天然に存在するエキソヌクレアーゼによって急速に分解される。λファージGamSタンパク質5またはカイサイト6を含むDNAを保護剤として使用したり、その末端2,7,8,9の化学修飾によって直鎖状DNAを直接保護したりするなど、この問題に対処する解決策があります。これらの方法はすべて、細胞抽出物への補給を必要とし、それは費用と時間がかかります。エキソヌクレアーゼV複合体(RecBCD)が細胞ライセート中の直鎖状DNAを分解することは長い間知られていました4。最近、私たちは、直鎖状DNAが、エキソヌクレアーゼ遺伝子(recBCD)のためにノックアウトされた細胞からのライセートではるかによく保護できることを示しました10。
このプロトコルでは、超音波処理溶解による大腸菌BL21 Rosetta2 ΔrecBCD株からの無細胞溶解物を調製するためのステップが詳細に説明される。超音波処理溶解は、いくつかのラボ11,12で採用されている一般的で手頃な技術です。この株から製造された抽出物は、線状DNAテンプレートからの発現をサポートするために、余分な成分やDNAテンプレートの修飾を追加する必要はありません。この方法は、天然大腸菌プロモーターからの線形DNA発現に特化した細胞抽出物のバッファー最適化という必須ステップに依存しています。直鎖状DNA発現のためのこの特定のバッファー最適化は、ネイティブσ70プロモーターがPCR産物の精製を回避しても、GamSタンパク質またはChi DNA補給なしで高タンパク質生産をもたらすための鍵であることが示されています10。直鎖状DNA発現のためのMg-gluの最適濃度は、プラスミドDNAのそれと同様であることがわかった。しかしながら、K−gluの最適濃度は、おそらく転写関連のメカニズムに起因する直鎖状DNAとプラスミドDNAの間に実質的な差を示した10。この方法を用いて発現されるタンパク質の機能性は、トーホールドスイッチの迅速なスクリーニングや酵素変異体の活性評価など、いくつかの用途で実証されています10。
このプロトコルは、変異型ΔrecBCD細胞抽出物と直鎖DNAの特異的キャリブレーションをテンプレートとして使用するだけで、大腸菌細胞フリーシステムで線状DNAテンプレートを使用するためのシンプルで効率的かつ費用対効果の高いソリューションを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、recBまたはrecBCDオペロンのいずれかのゲノムノックアウトを有する大腸菌BL21 Rosetta2から調製された細胞ライセートが、線状DNAテンプレートからの高タンパク質発現をサポートすることを示します。このプロトコルは、線状DNAテンプレートに特異的な段階的なライセートキャリブレーション手順を詳しく説明しており(図2)、これは直鎖DNA中?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACBとJLFは、ANR SINAPUV助成金(ANR-17-CE07-0046)による資金援助を認めています。JLFとJBは、ANR SynBioDiag助成金(ANR-18-CE33-0015)による資金援助を認めています。MSAとJLFは、ANR iCFree助成金(ANR-20-BiopNSE)による資金援助を認めています。JBは、ERCが「COMPUCELL」(付与番号657579)を開始するサポートを認めています。Centre de Biochimie Structuraleは、フランス統合構造生物学インフラストラクチャ(FRISBI)(ANR-10-INSB-05-01)からの支援を認めています。MKは、INRAeのMICA部門、パリサクレー大学、イルドフランス(IdF)地域のDIM-RFSI、およびANRドリーミー(ANR-21-CE48-003)からの資金援助を認めています。この作業は、欧州研究会議コンソリデーター賞(CLBへの865973)による資金提供によってサポートされました。
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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