Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la preparación y calibración tampón de extractos celulares de cepas knockout de exonucleasa V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD y ΔrecB). Este es un enfoque rápido, fácil y directo para la expresión en sistemas de síntesis de proteínas libres de células utilizando plantillas de ADN lineal.
Abstract
La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se ha vuelto recientemente muy popular en el campo de la biología sintética debido a sus numerosas ventajas. El uso de plantillas de ADN lineal para CFPS permitirá que la tecnología alcance su máximo potencial, disminuyendo el tiempo experimental al eliminar los pasos de clonación, transformación y extracción de plásmidos. El ADN lineal puede ser rápida y fácilmente amplificado por PCR para obtener altas concentraciones de la plantilla, evitando la posible toxicidad de la expresión in vivo. Sin embargo, los moldes lineales de ADN son degradados rápidamente por exonucleasas que están naturalmente presentes en los extractos celulares. Hay varias estrategias que se han propuesto para abordar este problema, como la adición de inhibidores de nucleasa o la modificación química de los extremos lineales del ADN para la protección. Todas estas estrategias cuestan tiempo y recursos adicionales y aún no han obtenido niveles cercanos al plásmido de expresión de proteínas. Aquí se presenta un protocolo detallado para una estrategia alternativa para usar plantillas de ADN lineal para CFPS. Mediante el uso de extractos celulares de células knockout deficientes en exonucleasa, las plantillas de ADN lineal permanecen intactas sin requerir ninguna modificación final. Presentamos los pasos de preparación del lisado celular de la cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación y calibración de tampón para Mg-glutamato (Mg-glu) y K-glutamato (K-glu) específicamente para ADN lineal. Este método es capaz de alcanzar niveles de expresión de proteínas comparables a los del ADN plásmido en CFPS de E. coli.
Introduction
Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se utilizan cada vez más como un método rápido, simple y eficiente para la ingeniería de biosensores, la fabricación descentralizada y la creación de prototipos de circuitos genéticos1. Debido a su gran potencial, los sistemas CFPS se utilizan regularmente en el campo de la biología sintética. Sin embargo, hasta ahora los sistemas CFPS dependen de plásmidos circulares que pueden limitar la tecnología de alcanzar su máximo potencial. La preparación del ADN plásmido depende de muchos pasos que consumen mucho tiempo durante la clonación y de grandes cantidades de aislamiento de ADN. Por otro lado, la amplificación por PCR de un plásmido, o una plantilla de ADN sintetizado, se puede utilizar simplemente para preparar plantillas CFPS en unas pocas horas 2,3. Por lo tanto, la aplicación de ADN lineal ofrece una solución prometedora para CFPS. Sin embargo, el ADN lineal es rápidamente degradado por exonucleasas naturalmente presentes en extractos celulares4. Existen soluciones que abordan este problema, como utilizarla proteína 5 del λ-fago GamS o el ADN que contiene los sitios Chi6 como agentes protectores, o proteger directamente el ADN lineal mediante la modificación química de sus extremos 2,7,8,9. Todos estos métodos requieren suplementos al extracto celular, que son costosos y requieren mucho tiempo. Se sabe desde hace mucho tiempo que el complejo exonucleasa V (RecBCD) degrada el ADN lineal en lisados celulares4. Recientemente, demostramos que el ADN lineal puede protegerse mucho mejor en lisados de células eliminadas para genes de exonucleasa (recBCD)10.
En este protocolo, se describen en detalle los pasos para la preparación de lisados libres de células de la cepa de E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación. La lisis de sonicación es una técnica común y asequible empleada por varios laboratorios11,12. Los extractos producidos a partir de esta cepa no necesitan la adición de ningún componente adicional o modificación de la plantilla de ADN para apoyar la expresión de plantillas de ADN lineal. El método se basa en el paso esencial de la optimización del tampón para extractos celulares específicamente para la expresión lineal de ADN de promotores nativos de E. coli. Se ha demostrado que esta optimización específica del tampón para la expresión lineal del ADN es la clave para que los promotores nativos de σ70 produzcan una alta producción de proteínas sin suplementos de proteína GamS o ADN Chi, incluso evitando la purificación de los productos de PCR10. Se encontró que la concentración óptima de Mg-glu para la expresión lineal de ADN era similar a la del ADN plásmido. Sin embargo, la concentración óptima de K-glu mostró una diferencia sustancial entre el ADN lineal y el plásmido, probablemente debido a un mecanismo relacionado con la transcripción10. La funcionalidad de las proteínas expresadas mediante este método se ha demostrado para varias aplicaciones, como el cribado rápido de los interruptores de punto de apoyo y la evaluación de la actividad de las variantes enzimáticas10.
Este protocolo proporciona una solución simple, eficiente y rentable para el uso de plantillas de ADN lineal en sistemas libres de células de E. coli simplemente utilizando extractos de células ΔrecBCD mutantes y calibración específica para ADN lineal como plantilla.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, mostramos que el lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genómico para el operón recB o recBCD admite una alta expresión de proteínas a partir de plantillas de ADN lineal. Este protocolo elabora un procedimiento de calibración de lisado paso a paso específico para plantillas de ADN lineal (Figura 2), que es un paso crítico que conduce a la alta expresión de promotores σ70 en ADN lineal, alcanzando niveles cercanos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB y JLF reconocen el apoyo financiero de la subvención ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF y JB reconocen el apoyo financiero de la subvención ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA y JLF reconocen el apoyo financiero de la subvención ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB agradece el apoyo del ERC que comienza “COMPUCELL” (número de subvención 657579). El Centre de Biochimie Structurale agradece el apoyo de la Infraestructura Francesa de Biología Estructural Integrada (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK agradece el apoyo financiero del departamento MICA de INRAe, la Université Paris-Saclay, DIM-RFSI de la región de Ile-de-France (IdF) y ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Este trabajo fue apoyado por la financiación a través del Premio Consolidador del Consejo Europeo de Investigación (865973 a CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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