Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi
Summary
Burada sunulan, Escherichia coli BL21 Rosetta2’nin (ΔrecBCD ve ΔrecB) ekzonükleaz V nakavt suşlarından hücre ekstraktlarının hazırlanması ve tampon kalibrasyonu için bir protokoldür. Bu, lineer DNA şablonlarını kullanarak hücresiz protein sentez sistemlerinde ekspresyon için hızlı, kolay ve doğrudan bir yaklaşımdır.
Abstract
Hücresiz protein sentezi (CFPS), sayısız avantajı nedeniyle sentetik biyoloji alanında son zamanlarda çok popüler hale gelmiştir. CFPS için lineer DNA şablonlarının kullanılması, klonlama, transformasyon ve plazmid ekstraksiyonu adımlarını ortadan kaldırarak deneysel süreyi azaltarak teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sağlayacaktır. Lineer DNA, şablonun yüksek konsantrasyonlarını elde etmek için PCR ile hızlı ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir, böylece potansiyel in vivo ekspresyon toksisitesi önlenir. Bununla birlikte, lineer DNA kalıpları hücre ekstraktlarında doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır. Bu problemin üstesinden gelmek için, nükleaz inhibitörlerinin eklenmesi veya korunma için lineer DNA uçlarının kimyasal modifikasyonu gibi önerilen birkaç strateji vardır. Tüm bu stratejiler ekstra zamana ve kaynaklara mal olur ve henüz plazmid protein ekspresyonu seviyelerini elde edememiştir. CFPS için lineer DNA kalıplarını kullanmak için alternatif bir strateji için ayrıntılı bir protokol burada sunulmuştur. Ekzonükleaz eksikliği olan nakavt hücrelerinden hücre ekstraktlarını kullanarak, lineer DNA şablonları herhangi bir son modifikasyon gerektirmeden bozulmadan kalır. Özellikle lineer DNA için Mg-glutamat (Mg-glu) ve K-glutamat (K-glu) için sonikasyon lizisi ve tampon kalibrasyonu ile Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan hücre lizatının hazırlık adımlarını sunuyoruz. Bu yöntem, E. coli CFPS’deki plazmid DNA’sından elde edilenle karşılaştırılabilir protein ekspresyon seviyelerine ulaşabilir.
Introduction
Hücresiz protein sentezi (CFPS) sistemleri, biyosensör mühendisliği, merkezi olmayan üretim ve genetik devrelerin prototiplenmesi için hızlı, basit ve verimli bir yöntem olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1. CFPS sistemleri büyük potansiyelleri nedeniyle sentetik biyoloji alanında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar CFPS sistemleri, teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sınırlayabilen dairesel plazmidlere dayanmaktadır. Plazmid DNA’sının hazırlanması, klonlama sırasında birçok zaman alıcı adıma ve büyük miktarda DNA izolasyonuna bağlıdır. Öte yandan, bir plazmidden veya sentezlenmiş bir DNA şablonundan PCR amplifikasyonu, CFPS şablonlarını birkaç saat içinde hazırlamak için kullanılabilir 2,3. Bu nedenle, lineer DNA uygulaması CFPS için umut verici bir çözüm sunmaktadır. Bununla birlikte, lineer DNA, hücresel ekstraktlarda doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır4. λ-faj GamS proteini5’i veya Chi bölgeleri6’yı içeren DNA’yı koruyucu ajanlar olarak kullanmak veya uçlarının kimyasal modifikasyonu ile doğrusal DNA’yı doğrudan korumak gibi bu sorunu ele alan çözümler vardır 2,7,8,9. Tüm bu yöntemler, pahalı ve zaman alıcı olan hücre ekstraktına takviyeler gerektirir. Ekzonükleaz V kompleksinin (RecBCD) hücre lizatlarındaki lineer DNA’yı bozduğu uzun zamandır bilinmektedir4. Son zamanlarda, lineer DNA’nın, ekzonükleaz genleri (recBCD)10 için nakavt edilen hücrelerden lizatlarda çok daha iyi korunabileceğini gösterdik.
Bu protokolde, E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan sonikasyon lizisi ile hücresiz lizatların hazırlanması için adımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sonication lizis birkaç laboratuar tarafından kullanılan yaygın ve uygun fiyatlı bir tekniktir11,12. Bu suştan üretilen ekstraktlar, lineer DNA kalıplarından gelen ifadeyi desteklemek için herhangi bir ekstra bileşenin veya DNA kalıbı modifikasyonunun eklenmesine ihtiyaç duymaz. Yöntem, özellikle yerli E. coli promotörlerinden doğrusal DNA ekspresyonu için hücre ekstraktları için tampon optimizasyonunun temel adımına dayanır. Lineer DNA ekspresyonu için bu spesifik tampon optimizasyonunun, yerel σ70 promotörlerinin GamS proteini veya Chi DNA takviyesi olmadan yüksek protein üretimi sağlaması için anahtar olduğu, hatta PCR ürünlerinin saflaştırılmasından kaçındığı gösterilmiştir10. Lineer DNA ekspresyonu için optimal Mg-glu konsantrasyonunun, plazmid DNA’sına benzer olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, optimal K-glu konsantrasyonu, muhtemelen transkripsiyonla ilgili bir mekanizma10’dan dolayı doğrusal ve plazmid DNA’sı arasında önemli bir fark göstermiştir. Bu yöntem kullanılarak ifade edilen proteinlerin işlevselliği, ayak parmağı anahtarlarının hızlı bir şekilde taranması ve enzim varyantlarının aktivite değerlendirmesi10 gibi çeşitli uygulamalar için gösterilmiştir.
Bu protokol, sadece mutant ΔrecBCD hücre ekstraktlarını ve lineer DNA için spesifik kalibrasyonu şablon olarak kullanarak E. coli hücresiz sistemlerde lineer DNA şablonlarını kullanmak için basit, verimli ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, E. coli BL21 Rosetta2’den hazırlanan hücre lizatının, recB veya recBCD operon için genomik nakavt ile doğrusal DNA şablonlarından yüksek protein ekspresyonunu desteklediğini gösteriyoruz. Bu protokol, lineer DNA şablonlarına özgü adım adım lizat kalibrasyon prosedürünü detaylandırır (Şekil 2), bu da lineer DNA’daki σ70 promotörlerinden yüksek ekspresyona yol açan ve equimolar DNA konsantrasyonları için plazmid seviyelerine ulaş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB ve JLF, ANR SINAPUV hibesi (ANR-17-CE07-0046) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. JLF ve JB, ANR SynBioDiag hibesi (ANR-18-CE33-0015) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. MSA ve JLF, ANR iCFree hibesi (ANR-20-BiopNSE) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. JB, ERC’nin “COMPUCELL” (hibe numarası 657579) başlatan desteğini kabul ediyor. Centre de Biochimie Structurale, Fransız Entegre Yapısal Biyoloji Altyapısı’nın (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01) desteğini kabul etmektedir. MK, INRAe’nin MICA bölümü, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) bölgesinin DIM-RFSI ve ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003) fon desteğini kabul etmektedir. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Ödülü (CLB’ye 865973) aracılığıyla finanse edilerek desteklenmiştir.
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
