Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione
Summary
Il presente protocollo descrive l’uso della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) per analizzare l’associazione e la cinetica di dissociazione del legame tra un aptamero del DNA e una tetraciclina, compresa la preparazione del campione, gli standard di esecuzione e i campioni e l’interpretazione dei dati risultanti.
Abstract
La determinazione dell’affinità e del comportamento di legame tra un aptamero e il suo bersaglio è il passo più cruciale nella selezione e nell’utilizzo di un aptamero per l’applicazione. A causa delle drastiche differenze tra l’aptamero e le piccole molecole, gli scienziati devono impegnarsi molto per caratterizzare le loro proprietà leganti. La calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è un approccio potente per questo scopo. L’ITC va oltre la determinazione delle costanti di dissociazione (Kd) e può fornire le variazioni di entalpia e la stechiometria di legame dell’interazione tra due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione, in modo che il processo possa misurare sensibilmente il legame tra le macromolecole e i loro piccoli bersagli. Qui, l’articolo introduce una procedura passo-passo della misurazione ITC di un aptamero selezionato con un piccolo bersaglio, la tetraciclina. Questo esempio dimostra la versatilità della tecnica e il suo potenziale per altre applicazioni.
Introduction
Gli aptameri sono frammenti di ssDNA o RNA selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati 1,2, che possono funzionare come elementi di riconoscimento avanzato o anticorpi chimici 3,4,5. Pertanto, l’affinità di legame e la specificità degli aptameri ai loro bersagli svolgono un ruolo cruciale nella selezione e nell’applicazione di un aptamero e la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stata ampiamente utilizzata per questi scopi di caratterizzazione. Molti approcci sono stati utilizzati per determinare l’affinità degli aptameri, tra cui ITC, risonanza plasmonica di superficie (SPR), titolazione colorimetrica, termoforesi su microscala (MST) e interferometria a biostrati (BLI). Tra questi, ITC è una delle ultime tecniche per determinare l’associazione termodinamica e cinetica di due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione 6,7. A differenza di altri metodi, ITC può offrire affinità di legame, diversi siti di legame e associazione termodinamica e cinetica (Figura 1A). Da questi parametri iniziali, le variazioni di energia libera di Gibbs e le variazioni di entropia sono determinate usando la seguente relazione:
ΔG = ΔH-TΔS
Ciò significa che ITC offre un profilo termodinamico completo dell’interazione molecolare per chiarire i meccanismi di legame (Figura 1B). Determinare l’affinità di legame per piccole molecole con un aptamero è difficile a causa delle dimensioni drasticamente diverse tra aptamero e bersaglio. Nel frattempo, ITC può fornire misurazioni sensibili senza etichettare e immobilizzare le molecole, il che fornisce un mezzo per mantenere la struttura naturale dell’aptamero e del bersaglio durante la misurazione. Con gli attributi menzionati, ITC può essere utilizzato come metodo standard per la caratterizzazione del legame tra un aptamero e piccoli bersagli.
Dopo la selezione da parte del gruppo Gu, questo aptamero è stato integrato con diverse piattaforme, tra cui biosensori elettrochimici basati su aptamero, un test aptamero enzimatico competitivo e una piastra di microtitolazione, che può ottenere un rilevamento ad alta produttività della tetraciclina 8,9,10. Tuttavia, le sue caratteristiche di legame non sono state chiarite abbastanza bene da sceglierela piattaforma 8 corretta; vale la pena caratterizzare il legame dell’aptamero alla tetraciclina usando ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato è stato modificato secondo le istruzioni di TA Instruments ed è sufficiente per determinare l’affinità di legame e la termodinamica di molti aptameri e bersagli selezionati presso il nostro centro. I passaggi cruciali di questa procedura includono lo scambio del buffer per avere un target corrispondente al ligando, l’esecuzione di campioni con parametri appropriati e la ricerca del modello di adattamento di binding appropriato per analizzare i dati. La registrazione continua del rilascio di ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento per la ricerca e lo sviluppo di Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
