تحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين باستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) لتحليل حركية الارتباط والتفكك للربط بين أبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين، بما في ذلك إعداد العينات، وتشغيل المعايير والعينات، وتفسير البيانات الناتجة.
Abstract
إن تحديد التقارب والسلوك الملزم بين aptamer وهدفه هو الخطوة الأكثر أهمية في اختيار واستخدام aptamer للتطبيق. نظرا للاختلافات الجذرية بين الأبتامر والجزيئات الصغيرة ، يحتاج العلماء إلى بذل الكثير من الجهد في توصيف خصائصها الملزمة. يعد كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) نهجا قويا لهذا الغرض. يتجاوز ITC تحديد ثوابت الانفصال (Kd) ويمكن أن يوفر تغيرات المحتوى الحراري وقياس stoichiometry المرتبط للتفاعل بين جزيئين في مرحلة الحل. يجري هذا النهج معايرة مستمرة باستخدام جزيئات خالية من الملصقات ويسجل الحرارة المنبعثة بمرور الوقت على أحداث الربط التي تنتجها كل معايرة بالتحليل الحجمي ، بحيث يمكن للعملية قياس الارتباط بين الجزيئات الكبيرة وأهدافها الصغيرة بحساسية. هنا ، تقدم المقالة إجراء خطوة بخطوة لقياس ITC ل aptamer مختار مع هدف صغير ، التتراسيكلين. يثبت هذا المثال براعة التقنية وإمكاناتها للتطبيقات الأخرى.
Introduction
Aptamers هي شظايا ssDNA أو RNA يتم اختيارها من خلال عملية تطور ذات تقارب وخصوصية عالية الارتباط بالأهداف المرجوة1,2 ، والتي يمكن أن تعمل كعناصر التعرف المتقدمة أو الأجسام المضادة الكيميائية 3,4,5. وبالتالي ، فإن التقارب والخصوصية الملزمين ل aptamers لأهدافهم يلعبان دورا حاسما في اختيار وتطبيق aptamer ، وقد تم استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) على نطاق واسع لأغراض التوصيف هذه. تم استخدام العديد من الأساليب لتحديد تقارب aptamers ، بما في ذلك ITC ، ورنين البلازمون السطحي (SPR) ، والمعايرة بالتحليل الحجمي اللوني ، والرحلان الحراري المجهري (MST) ، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI). من بينها ، ITC هي واحدة من أحدث التقنيات لتحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لجزيئين في مرحلة الحل. يقوم هذا النهج بإجراء معايرة مستمرة باستخدام جزيئات خالية من الملصقات ويسجل الحرارة المنبعثة بمرور الوقت على أحداث الربط الناتجة عن كل معايرة 6,7. وخلافا للطرق الأخرى، يمكن لمركز التجارة الدولية أن يوفر تقاربا ملزما، والعديد من مواقع الربط، والارتباط الديناميكي الحراري والحركي (الشكل 1 ألف). من هذه المعلمات الأولية ، يتم تحديد تغيرات الطاقة الحرة Gibbs وتغيرات الإنتروبيا باستخدام العلاقة التالية:
ΔG = ΔH-TΔS
وهذا يعني أن مركز التجارة الدولية يقدم لمحة ديناميكية حرارية كاملة للتفاعل الجزيئي لتوضيح آليات الربط (الشكل 1B). من الصعب تحديد تقارب الارتباط للجزيئات الصغيرة ذات الأبتامر بسبب الأحجام المختلفة بشكل كبير بين أبتامر والهدف. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن يوفر مركز التجارة الدولية قياسا حساسا دون وضع علامات على الجزيئات وشل حركتها ، مما يوفر وسيلة للحفاظ على البنية الطبيعية للأبتيمر والهدف أثناء القياس. مع السمات المذكورة ، يمكن استخدام ITC كطريقة قياسية لتوصيف الارتباط بين aptamer والأهداف الصغيرة.
بعد الاختيار من قبل مجموعة Gu ، تم دمج هذا aptamer مع منصات مختلفة ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الحيوية الكهروكيميائية القائمة على aptamer ، وفحص aptamer المرتبط بالإنزيم التنافسي ، ولوحة microtiter ، والتي يمكن أن تحقق كشفا عالي الإنتاجية للتتراسيكلين 8,9,10. ومع ذلك ، لم يتم توضيح خصائصه الملزمة بشكل جيد بما يكفي لاختيار النظام الأساسيالمناسب 8 ؛ يجدر توصيف ربط الأبتامر بالتتراسيكلين باستخدام ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تعديل الطريقة المعروضة هنا وفقا لتعليمات من TA Instruments وهي كافية لتحديد تقارب الارتباط والديناميكا الحرارية للعديد من aptamers والأهداف المختارة في مركزنا. تتضمن الخطوات الحاسمة من هذا الإجراء تبادل المخزن المؤقت للحصول على هدف يطابق الرباط ، وتشغيل العينات بمعلمات مناسبة ، وإيجاد نموذج من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل تمويل البحث والتطوير من Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
