等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)
Summary
本プロトコルは、等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、DNAアプタマーとテトラサイクリンの間の結合の会合および解離速度論を分析し、サンプル調製、標準およびサンプルの実行、および結果のデータの解釈を含むことを説明しています。
Abstract
アプタマーとその標的との間の結合親和性と挙動の決定は、適用するアプタマーを選択して使用する上で最も重要なステップです。アプタマーと低分子の間には劇的な違いがあるため、科学者はそれらの結合特性の特性評価に多大な努力を払う必要があります。等温滴定熱量測定(ITC)は、この目的のための強力なアプローチです。ITCは、解離定数(Kk)の決定を超えて、溶液相における2つの分子間の相互作用のエンタルピー変化と結合化学量論を提供することができます。このアプローチは、ラベルフリー分子を使用して連続滴定を行い、各滴定によって生成される結合イベントで時間の経過とともに放出された熱を記録するため、このプロセスでは高分子とその小さなターゲット間の結合を高感度に測定できます。ここでは、小さな標的であるテトラサイクリンを用いて選択されたアプタマーのITC測定の段階的な手順を紹介します。この例は、この手法の汎用性と他のアプリケーションへの可能性を証明しています。
Introduction
アプタマーは、所望の標的1,2に対する高い結合親和性および特異性を有する進化過程を通じて選択されたssDNAまたはRNA断片であり、これは高度な認識要素または化学抗体として働き得る3,4,5。したがって、アプタマーの標的への結合親和性と特異性は、アプタマーの選択と適用において重要な役割を果たし、等温滴定熱量測定(ITC)はこれらの特性評価の目的で広く使用されています。ITC、表面プラズモン共鳴(SPR)、比色滴定、マイクロスケール熱泳動(MST)、バイオレイヤー干渉法(BLI)など、アプタマーの親和性を決定するために多くのアプローチが使用されてきました。その中で、ITCは、溶液相における2つの分子の熱力学的および速度論的会合を決定するための最新の技術の1つです。このアプローチは、ラベルフリー分子を用いて連続滴定を行い、各滴定によって生じる結合事象に対して経時的に放出された熱を記録する6,7。他の方法とは異なり、ITCは結合親和性、いくつかの結合部位、および熱力学的および速度論的会合を提供することができます(図1A)。これらの初期パラメータから、ギブズの自由エネルギー変化とエントロピー変化は、次の関係を使用して決定されます。
ΔG = ΔH-TΔS
つまり、ITCは分子間相互作用の完全な熱力学的プロファイルを提供し、結合メカニズムを解明します(図1B)。アプタマーと低分子の結合親和性の決定は、アプタマーとターゲットのサイズが大きく異なるため困難です。一方、ITCは分子を標識したり固定化したりすることなく高感度な測定が可能で、測定中にアプタマーやターゲットの自然な構造を保つことができます。上記の特性により、ITCは、アプタマーと小さなターゲットとの間の結合の特性評価のための標準的な方法として使用できます。
Guグループによる選択後、このアプタマーは、電気化学的アプタマーベースのバイオセンサー、競合する酵素結合アプタマーアッセイ、テトラサイクリン8,9,10のハイスループット検出を達成できるマイクロタイタープレートなど、さまざまなプラットフォームと統合されました。しかしながら、その結合特性は、適切なプラットフォームを選択するのに十分なほど十分に解明されていない8;ITCを用いてアプタマーのテトラサイクリンへの結合を特徴付ける価値がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する方法は、TA Instrumentsの指示に従って変更されており、当センターで選択された多くのアプタマーとターゲットの結合親和性と熱力学を決定するのに十分です。この手順の重要なステップには、リガンドに一致するターゲットを持つようにバッファーを交換すること、適切なパラメータでサンプルを実行すること、およびデータを分析するための適切な結合フィッティングモデ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Aptagen LLCの研究開発資金によって支援されました。
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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