Bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til en DNA-aptamer og tetracyklin ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) for å analysere assosiasjons- og dissosiasjonskinetikken til bindingen mellom en DNA-aptamer og tetracyklin, inkludert prøvepreparering, løpende standarder og prøver, og tolkning av de resulterende dataene.

Abstract

Bestemmelsen av bindende affinitet og oppførsel mellom en aptamer og dens mål er det mest avgjørende trinnet i å velge og bruke en aptamer for anvendelse. På grunn av de drastiske forskjellene mellom aptamer og små molekyler, må forskere legge mye arbeid i å karakterisere deres bindingsegenskaper. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er en kraftig tilnærming til dette formålet. ITC går utover å bestemme disassosiasjonskonstanter (K_d) og kan gi entalpiendringer og bindende støkiometri av samspillet mellom to molekyler i løsningsfasen. Denne tilnærmingen utfører kontinuerlig titrering ved hjelp av etikettfrie molekyler og registrerer frigjort varme over tid på bindingshendelsene produsert av hver titrering, slik at prosessen følsomt kan måle bindingen mellom makromolekyler og deres små mål. Her introduserer artikkelen en trinnvis prosedyre for ITC-måling av en valgt aptamer med et lite mål, tetracyklin. Dette eksemplet viser allsidigheten til teknikken og dens potensial for andre applikasjoner.

Introduction

Aptamerer er ssDNA- eller RNA-fragmenter valgt gjennom en evolusjonsprosess med høy bindingsaffinitet og spesifisitet til de ønskede målene ^1,2, som kan fungere som avanserte gjenkjenningselementer eller kjemiske antistoffer 3,4,5. Dermed spiller aptamerenes bindingsaffinitet og spesifisitet til deres mål en avgjørende rolle i valg og anvendelse av en aptamer, og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) har blitt mye brukt til disse karakteriseringsformålene. Mange tilnærminger har blitt brukt til å bestemme affiniteten til aptamerer, inkludert ITC, overflateplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, mikroskala termoforese (MST) og Bio-Layer Interferometry (BLI). Blant dem er ITC en av de nyeste teknikkene for å bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til to molekyler i løsningsfasen. Denne tilnærmingen utfører kontinuerlig titrering ved hjelp av etikettfrie molekyler og registrerer frigjort varme over tid på bindingshendelsene produsert ved hver titrering ^6,7. I motsetning til andre metoder kan ITC tilby bindingsaffinitet, flere bindingssteder og termodynamisk og kinetisk assosiasjon (figur 1A). Fra disse innledende parametrene bestemmes Gibbs frie energiendringer og entropiendringer ved hjelp av følgende forhold:

ΔG = ΔH-TΔS

Det betyr at ITC tilbyr en komplett termodynamisk profil av den molekylære interaksjonen for å belyse bindingsmekanismene (figur 1B). Det er vanskelig å bestemme bindingsaffiniteten for små molekyler med aptamer på grunn av de drastisk forskjellige størrelsene mellom aptamer og mål. I mellomtiden kan ITC gi sensitiv måling uten merking og immobilisering av molekyler, noe som gir et middel til å holde den naturlige strukturen til aptameren og målet under målingen. Med de nevnte attributtene kan ITC brukes som standardmetode for karakterisering av binding mellom en aptamer og små mål.

Etter valg av Gu-gruppen ble denne aptameren integrert med forskjellige plattformer, inkludert elektrokjemiske aptamerbaserte biosensorer, en konkurransedyktig enzymbundet aptameranalyse og en mikrotiterplate som kan oppnå høy gjennomstrømningsdeteksjon av tetracyklin ^8,9,10. Dens bindende egenskaper er imidlertid ikke belyst godt nok til å velge riktig plattform⁸; det er verdt å karakterisere bindingen av aptameren til tetracyklinen ved hjelp av ITC.

Protocol

MERK: Figur 2 viser hovedtrinnene i ITC-eksperimentet for å bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til en DNA-aptamer og tetracyklin. 1. Klargjøring av prøver MERK: Prøver for ITC må fremstilles i samme buffer for både aptamer og ligand for å unngå varmeutslipp forårsaket av blanding av forskjellige buffere fra prøvecellen og sprøyten. Dette oppnås vanligvis gjennom dialyse av alle materialer i…

Representative Results

ITC gir en nøyaktig disassosiasjonskonstant (Kd), bindingsstøkiometrien og de termodynamiske parametrene for tomolekylære interaksjoner6. I dette eksemplet binder aptameren valgt av Kim et al.9,11 til tetracyklin med bindingsaffiniteter av K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant nok ble denne bindingen bestemt ved bruk av likevektsfiltreringsmetoden og en rapportert K<sub…

Discussion

Metoden som presenteres her ble modifisert i henhold til instruksjon fra TA Instruments og er tilstrekkelig til å bestemme bindingsaffiniteten og termodynamikken til mange utvalgte aptamerer og mål ved vårt senter. Viktige trinn fra denne prosedyren inkluderer utveksling av bufferen for å ha et mål som samsvarer med liganden, kjøre prøver med riktige parametere og finne riktig bindingstilpasningsmodell for å analysere dataene. Kontinuerlig registrering av varmeutslipp krever eliminering av all støyvarme, for eks…

Materials

5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5