Bestämning av den termodynamiska och kinetiska föreningen av en DNA-aptamer och tetracyklin med användning av isotermisk titreringskalorimetri
Summary
Detta protokoll beskriver användningen av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) för att analysera associerings- och dissociationskinetiken för bindningen mellan en DNA-aptamer och tetracyklin, inklusive provberedning, körstandarder och prover och tolkning av resulterande data.
Abstract
Bestämningen av bindande affinitet och beteende mellan en aptamer och dess mål är det viktigaste steget i att välja och använda en aptamer för applikation. På grund av de drastiska skillnaderna mellan aptameren och små molekyler måste forskare lägga mycket ansträngning på att karakterisera deras bindande egenskaper. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) är ett kraftfullt tillvägagångssätt för detta ändamål. ITC går utöver att bestämma disassociationskonstanter (Kd) och kan ge entalpiförändringar och bindande stökiometri av interaktionen mellan två molekyler i lösningsfasen. Detta tillvägagångssätt utför kontinuerlig titrering med hjälp av etikettfria molekyler och registrerar frigjord värme över tiden vid bindningshändelserna som produceras av varje titrering, så att processen känsligt kan mäta bindningen mellan makromolekyler och deras små mål. Häri introducerar artikeln en steg-för-steg-procedur för ITC-mätning av en vald aptamer med ett litet mål, tetracyklin. Detta exempel bevisar teknikens mångsidighet och dess potential för andra applikationer.
Introduction
Aptamers är ssDNA- eller RNA-fragment utvalda genom en evolutionsprocess med hög bindningsaffinitet och specificitet till de önskade målen 1,2, som kan fungera som avancerade igenkänningselement eller kemiska antikroppar 3,4,5. Således spelar aptamers bindande affinitet och specificitet till sina mål en avgörande roll vid valet och tillämpningen av en aptamer, och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) har använts i stor utsträckning för dessa karakteriseringsändamål. Många metoder har använts för att bestämma affiniteten hos aptamerer, inklusive ITC, ytplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, termofores i mikroskala (MST) och bioskiktsinterferometri (BLI). Bland dem är ITC en av de senaste teknikerna för att bestämma den termodynamiska och kinetiska föreningen av två molekyler i lösningsfasen. Detta tillvägagångssätt utför kontinuerlig titrering med hjälp av etikettfria molekyler och registrerar frigjord värme över tiden vid de bindningshändelser som produceras av varje titrering 6,7. Till skillnad från andra metoder kan ITC erbjuda bindningsaffinitet, flera bindningsställen och termodynamisk och kinetisk association (figur 1A). Från dessa initiala parametrar bestäms Gibbs fria energiförändringar och entropiförändringar med hjälp av följande förhållande:
ΔG = ΔH-TΔS
Det betyder att ITC erbjuder en komplett termodynamisk profil för den molekylära interaktionen för att belysa bindningsmekanismerna (figur 1B). Att bestämma bindningsaffiniteten för små molekyler med en aptamer är svårt på grund av de drastiskt olika storlekarna mellan aptamer och mål. Under tiden kan ITC tillhandahålla känslig mätning utan märkning och immobiliserande molekyler, vilket ger ett sätt att hålla den naturliga strukturen hos aptameren och målet under mätningen. Med de nämnda attributen kan ITC användas som standardmetod för karakterisering av bindning mellan en aptamer och små mål.
Efter selektion av Gu-gruppen integrerades denna aptamer med olika plattformar, inklusive elektrokemiska aptamerbaserade biosensorer, en konkurrenskraftig enzymbunden aptameranalys och en mikrotiterplatta, som kan uppnå högkapacitetsdetektering av tetracyklin 8,9,10. Dess bindande egenskaper har dock inte belysts tillräckligt bra för att välja rätt plattform8; det är värt att karakterisera bindningen av aptameren till tetracyklin med hjälp av ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteras här modifierades enligt instruktioner från TA Instruments och är tillräcklig för att bestämma bindningsaffiniteten och termodynamiken hos många utvalda aptamerer och mål i vårt centrum. Viktiga steg från denna procedur inkluderar att utbyta bufferten för att ha ett mål som matchar liganden, köra prover med rätt parametrar och hitta lämplig bindningspassningsmodell för att analysera data. Kontinuerlig registrering av värmeavgivning kräver att all bullervärme elimineras, till exem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av forsknings- och utvecklingsfinansieringen från Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
