Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.
Abstract
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans interagiert mit einer großen Vielfalt von Mikroorganismen in der Natur. Im Allgemeinen wird C. elegans häufig in faulem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in faulen Früchten wie Äpfeln oder auf Komposthaufen. Es ist auch mit bestimmten wirbellosen Wirten wie Schnecken und Asseln verbunden. Diese Lebensräume sind reich an Mikroben, die als Nahrung für C. elegans dienen und auch den Nematodendarm persistent besiedeln können. Bis heute ist die genaue Vielfalt und Konsistenz der einheimischen C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir einen geeigneten Ansatz, um C. elegans aus der Natur zu isolieren und die Mikrobiota von Würmern zu charakterisieren. Nematoden können leicht aus Kompostmaterial, verrottenden Äpfeln, Schnecken isoliert oder durch das Platzieren von Äpfeln auf Komposthaufen angezogen werden. Die Hauptzeit für den Fund von C. elegans in der nördlichen Hemisphäre ist von September bis November. Würmer können aus gesammeltem Substratmaterial ausgewaschen werden, indem das Substrat in Pufferlösung getaucht wird, gefolgt von der Sammlung von Nematoden und deren Transfer auf Nematodenwachstumsmedium oder PCR-Puffer zur anschließenden Analyse. Wir veranschaulichen weiterhin, wie die Proben verwendet werden können, um die wurmassoziierten Mikroorganismen zu isolieren und zu reinigen und Würmer für die 16S ribosomale RNA-Analyse der Zusammensetzung der Mikrobiota-Gemeinschaft zu verarbeiten. Insgesamt können die beschriebenen Methoden neue Forschungen zur Charakterisierung der C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg anregen und so zu einem umfassenden Verständnis der Vielfalt und Stabilität der Mikrobiota des Fadenwurms als Grundlage für zukünftige funktionelle Forschung beitragen.
Introduction
In der Natur wird C. elegans häufig in faulem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in faulen Früchten wie Äpfeln oder auf Komposthaufen1. Es ist auch mit bestimmten wirbellosen Wirten wie Schnecken und Asseln assoziiert 2,3. Diese Lebensräume sind reich an Mikroben, die nicht nur als Nahrung für den Wurm dienen, sondern auch stabile Assoziationen mit ihm bilden können. Informationen zur Vielfalt natürlich assoziierter Mikroorganismen wurden erst 2016 veröffentlicht 4,5,6. Seitdem haben diese und nur wenige neuere Studien gezeigt, dass C. elegans mit einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen assoziiert ist, am häufigsten einschließlich Bakterien der Gattung Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter und einige andere 6,7,8. Mehrere assoziierte Bakterien können den Wurmdarm stabil besiedeln, wenn auch nicht alle 6,9,10,11,12. Sie sind wahrscheinlich von zentraler Bedeutung für unser Verständnis der Biologie von C. elegans, da sie Nahrung liefern, vor Krankheitserregern und möglicherweise anderen Stressoren schützen und zentrale Merkmale der Lebensgeschichte wie Fortpflanzungsrate, Entwicklung oder Verhaltensreaktionen beeinflussen können.
Zum Beispiel können natürlich assoziierte Isolate der Gattungen Pseudomonas, Ochrobactrum und auch Enterobacter oder Gluconobacter den Wurm auf unterschiedliche Weise vor Erregerinfektion und -abtötung schützen 5,6,11,13,14. Ein spezifisches Isolat der Gattung Comamonas beeinflusst die Nahrungsreaktion, Entwicklung, Lebensdauer und Fruchtbarkeit von Nematoden15,16,17. Providencia-Bakterien produzieren den Neuromodulator Tyramin und modulieren dadurch die Aktivität des Nervensystems des Wirts und die daraus resultierenden Verhaltensreaktionen18. Es wurde gezeigt, dass eine Reihe verschiedener natürlich assoziierter Bakterien die Wachstumsrate, die Fruchtbarkeit und die Verhaltensreaktionen der Bevölkerung beeinflusst 5,6,9,11,19.
Bis heute ist die genaue Vielfalt und Konsistenz der einheimischen C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg nicht vollständig verstanden, und weitere Assoziationen zwischen dem Wurm und Mikroben aus seiner Umgebung müssen noch aufgedeckt werden. Mehrere frühere Studien verwendeten Bakterienstämme, die aus einer Bodenumgebung, natürlichen C. elegans-Lebensräumen oder aus Mesokosmenexperimenten (dh Laborumgebungen, die natürliche Lebensräume nachbilden) mit C. elegans-Laborstämmen 4,5,20 isoliert wurden. Obwohl diese Studien neue Erkenntnisse über den Einfluss von Mikroben auf bestimmte Nematodenmerkmale (z.B. Nematodenstoffwechsel21) lieferten, ist die Relevanz dieser Interaktionen für die Biologie von C. elegans in der Natur unklar. Daher beschreibt dieses Manuskript die Methoden, C. elegans direkt aus der Natur zu isolieren und die natürlich assoziierten Mikroben sowohl aus einzelnen Würmern als auch aus Gruppen von Würmern zu isolieren und anschließend zu charakterisieren. Die beschriebenen Methoden sind eine aktualisierte und verbesserte Version der bisher verwendeten Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von natürlichem C. elegans und seiner nativen Mikrobiota 2,6,7. In Anbetracht der Tatsache, dass C. elegans bei der Zersetzung von Pflanzenmaterial auf der ganzen Welt weit verbreitet ist (insbesondere in verrottenden Früchten, gemäßigten Regionen und im Herbst)1,2,22,23,24,25, kann dieses Protokoll von jedem Labor angewendet werden, wann immer Interesse an einer Beziehung zu C. elegans besteht. Merkmale zu natürlich assoziierten Mikroben und damit zu einem natürlich relevanteren Kontext. Letzteres ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis der Biologie des Fadenwurms, da aus einer Vielzahl anderer Wirtssysteme bekannt ist, dass die assoziierte Mikrobiota verschiedene Merkmale der Lebensgeschichte beeinflussen kann26, ein Aspekt, der derzeit in der Vielzahl von C. elegans-Studien in fast allen lebenswissenschaftlichen Disziplinen weitgehend vernachlässigt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist einer der am intensivsten untersuchten Modellorganismen in der biologischen Forschung. Es wurde von Sydney Brenner in den 1960er Jahren eingeführt, ursprünglich zum Verständnis der Entwicklung und der Funktion des Nervensystems29. Seitdem ist C. elegans zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung grundlegender Prozesse in allen biologischen Disziplinen geworden, einschließlich Verhaltensbiologie, Neurobiologie, Altern, Evol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Projekte A1.1 und A1.2 des Sonderforschungsbereichs 1182 “Entstehung und Funktion von Metaorganismen”). Wir danken den Mitgliedern des Schulenburg-Labors für ihre Beratung und Unterstützung.
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