Syngene orthotope Allotransplantate der Maus zur Modellierung von Bauchspeicheldrüsenkrebs
Summary
Syngene orthotope Allotransplantate der Maus des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse (PDAC) rekapitulieren die Biologie, die Phänotypen und das therapeutische Ansprechen von Krankheitssubtypen. Aufgrund ihrer schnellen, reproduzierbaren Tumorprogression sind sie in präklinischen Studien weit verbreitet. In dieser Arbeit zeigen wir gängige Praktiken zur Generierung dieser Modelle, indem wir syngene murine PDAC-Kulturen in die Bauchspeicheldrüse injizieren.
Abstract
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine sehr komplexe Erkrankung, die durch eine heterogene Tumormikroumgebung gekennzeichnet ist, die aus einem vielfältigen Stroma, Immunzellen, Gefäßen, Nerven und Komponenten der extrazellulären Matrix besteht. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Mausmodelle von PDAC entwickelt, um die Herausforderungen zu bewältigen, die sich aus seiner Progression, seinem Metastasierungspotenzial und seiner phänotypischen Heterogenität ergeben. Immunkompetente orthotope Maus-Allotransplantate von PDAC haben sich aufgrund ihrer schnellen und reproduzierbaren Tumorprogression im Vergleich zu gentechnisch veränderten Mausmodellen als vielversprechend erwiesen. Darüber hinaus ermöglichen zelllinienbasierte orthotope Allotransplantat-Mausmodelle in Kombination mit ihrer Fähigkeit, die biologischen Merkmale nachzuahmen, die in autochthonen PDAC beobachtet wurden, groß angelegte In-vivo-Experimente . Daher werden diese Modelle in präklinischen Studien häufig für schnelle Genotyp-Phänotyp- und Drug-Response-Analysen eingesetzt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren und robusten Ansatz zur erfolgreichen Injektion von primären PDAC-Zellkulturen der Maus in die Bauchspeicheldrüse von syngenen Empfängermäusen bereitzustellen. Neben den technischen Details werden wichtige Informationen gegeben, die vor der Durchführung dieser Experimente beachtet werden müssen.
Introduction
In jüngster Zeit wurde PDAC zur dritthäufigsten krebsbedingten Todesursache in der westlichen Welt1. Es verursacht die höchste Sterblichkeitsrate unter allen Krebsarten und eine 10-Jahres-Gesamtüberlebensrate von ~1%, die sich seit Jahrzehnten nicht geändert hat2. Aufgrund des mangelnden Fortschritts bei der PDAC-Behandlung wird erwartet, dass diese Krankheit in den nächsten zehn Jahren die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache sein wird3.
PDAC-Tumoren sind komplexe Einheiten, die durch eine vielfältige Tumormikroumgebung (TME) gekennzeichnet sind, die aus einer heterogenen Anordnung von Stroma-, vaskulären, immunen und extrazellulären Matrixkomponenten besteht4. Unterschiede in der Zusammensetzung der TME beeinflussen die Krankheitsprognose und das Ansprechen auf die Therapie 4,5,6. In der Tat haben viele Studien gezeigt, dass der basale, mesenchymale Subtyp der PDAC mit einem stark immunsuppressiven TME assoziiert ist und ein verringertes Überleben und mangelndes Ansprechen auf Therapien zeigt 7,8,9,10,11,12. Daher bleibt ein tieferes Verständnis der Unterschiede in der TME-Zusammensetzung und wie diese Merkmale die Tumorbiologie beeinflussen, ein wichtiger Faktor für die Entwicklung molekular präziser Therapien. Um die Biologie hinter diesem komplexen Phänotyp besser zu verstehen und therapeutische Strategien zu identifizieren, die in der Lage sind, die Barriere zu überwinden, die die TME von PDAC darstellt, sind In-vivo-Modelle unverzichtbar.
Ein Schlüsselaspekt für jedes präklinische Krebsmodellsystem ist, dass es menschliche Phänotypen nachahmen und sowohl die genetische Heterogenität als auch das Milieu rekapitulieren sollte, das die Vielzahl von Stroma- und Immunpopulationen umfasst, aus denen sich das TME zusammensetzt. Bei der Auswahl von Mausmodellen für die präklinische Forschung müssen daher mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Um die Tumor-Immun-Interaktion zu untersuchen, können histokompatible Krebszelllinien in syngene immunkompetente Mäuse injiziert werden. In den meisten Fällen werden diese subkutan in die Flanke der Maus injiziert, was eine einfache Tumorüberwachung durch Abtasten oder visuelle Inspektion ermöglicht. Die resultierenden Modelle ahmen jedoch nicht das Wachstum von Tumorzellen in ihrem Ursprungsorgan nach. Daher wurden orthotope Transplantationen zum Goldstandard für Allotransplantatmodelle.
Orthotope Allotransplantate der Maus haben mehrere Vorteile: Sie sind kostengünstig, können mit einem relativ einfachen Verfahren erzeugt werden und führen zu Modellen mit bekannter molekularer Zusammensetzung sowie einer reproduzierbaren und vorhersagbaren Tumorprogression und einem Phänotyp. Während patientenabgeleitete Xenotransplantatmodelle das Verhalten menschlicher PDAC-Zellen genau repräsentieren, schränkt die Notwendigkeit der Implantation in immundefiziente Mäuse zur Vermeidung der Transplantatabstoßung die Analyse der Tumor-Immun- und Tumor-Stroma-Interaktionen ein, so dass die Forscher nur ein Teilbild der Komplexität dieser Tumore erfassen können. Syngene orthotope Allotransplantate von PDAC sind in dieser Hinsicht auch im Vergleich zu gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs) im Vorteil. GEMMs rekapitulieren genau die humane PDAC-Tumorgenese und die bei PDAC-Patienten beobachtete Heterogenität. Aufgrund dieser Merkmale können GEMM-Tumoren jedoch eine hohe Varianz in ihrer genetischen Ausstattung, Tumorprogression, Aggressivität, histologischen Differenzierung und TME-Zusammensetzung aufweisen. Während dies in bestimmten Studien von Vorteil sein kann, schränkt es Genotyp-zu-Phänotyp-Studien und die fokussierte Untersuchung von PDAC-Phänotypenein 13. Daher stellen orthotope Allotransplantate der Maus einen guten Kompromiss und ein gutes Modell dar, um Tumor-Wirts- und Behandlungsstudien in vivo durchzuführen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für orthotope Transplantationsexperimente von murinen PDAC-Zellen in die Bauchspeicheldrüse der Maus beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syngene orthotope Allotransplantate der Maus stellen aufgrund ihrer Kosteneffektivität, Reproduzierbarkeit und relativ einfachen experimentellen Verfahren ein robustes Modell für präklinische Studiendar 13,15. Diese Modelle erlauben nicht nur die Untersuchung von Tumor-Wirt-Interaktionen, sondern garantieren auch den Erhalt der genetischen Heterogenität der Tumoren, aus denen sie stammen, wenn primäre Mauszellkulturen für das Experiment verwendet werden.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei der TUM Tierklinik und der bildgebenden Core Facility der Klinik für Nuklearmedizin, Klinikum rechts der Isar, für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wurde gefördert durch das Deutsche Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Projekt-ID 329628492 P06, P11 und S01) bis D.S., die Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 und 2017.091.2) bis D.S. und den Europäischen Forschungsrat (ERC CoG Nr. 648521, bis D.S.).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
