Syngeneic mus ortotopiske allotransplantater til model kræft i bugspytkirtlen
Summary
Syngeneic mus ortotopiske allotransplantater af pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) rekapitulerer biologi, fænotyper og terapeutiske reaktioner af sygdomsundertyper. På grund af deres hurtige, reproducerbare tumorprogression anvendes de i vid udstrækning i prækliniske undersøgelser. Her viser vi almindelig praksis for at generere disse modeller og injicere syngeneic murine PDAC-kulturer i bugspytkirtlen.
Abstract
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er en meget kompleks sygdom præget af et heterogent tumormikromiljø, der består af forskellige stroma-, immunceller, kar, nerver og ekstracellulære matrixkomponenter. I årenes løb er forskellige musemodeller af PDAC blevet udviklet for at løse udfordringerne ved dets progression, metastatiske potentiale og fænotypiske heterogenitet. Immunokompetente ortotopiske allotransplantater af PDAC har vist sig lovende på grund af deres hurtige og reproducerbare tumorprogression sammenlignet med genetisk manipulerede musemodeller. Desuden kombineret med deres evne til at efterligne de biologiske egenskaber, der observeres i autokton PDAC, muliggør cellelinjebaserede ortopopiske allograftmusemodeller storskala in vivo-eksperimenter . Disse modeller anvendes således i vid udstrækning i prækliniske studier til hurtige genotype-fænotype- og lægemiddelresponsanalyser. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en reproducerbar og robust tilgang til vellykket injektion af PDAC-cellekulturer med primær mus i bugspytkirtlen hos syngeneiske recipientmus. Ud over de tekniske detaljer gives vigtige oplysninger, der skal overvejes, inden disse eksperimenter udføres.
Introduction
For nylig blev PDAC den tredje førende årsag til kræftrelaterede dødsfald i den vestlige verden1. Det forårsager den højeste dødelighed blandt alle kræftformer og en 10 års samlet overlevelsesrate på ~ 1%, hvilket ikke har ændret sig i årtier2. På grund af manglende fremskridt i PDAC-behandling forventes denne sygdom at blive den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald inden for det næste årti3.
PDAC-tumorer er komplekse enheder kendetegnet ved et forskelligartet tumormikromiljø (TME) sammensat af en heterogen samling af stroma-, vaskulære, immun- og ekstracellulære matrixkomponenter4. Forskelle i sammensætningen af TME påvirker sygdomsprognosen og respons på behandlingen 4,5,6. Faktisk har mange undersøgelser vist, at den basale lignende, mesenkymale undertype af PDAC er forbundet med en stærkt immunsuppressiv TME og viser nedsat overlevelse og manglende respons på terapier 7,8,9,10,11,12. Derfor er en dybere forståelse af forskellene i TME-sammensætning, og hvordan disse egenskaber påvirker tumorbiologi, fortsat en vigtig faktor for udviklingen af molekylært præcise terapier. For bedre at forstå biologien bag denne komplekse fænotype og identificere terapeutiske strategier, der er i stand til at overvinde den barriere, som TME af PDAC udgør, er in vivo-modeller uundværlige.
Et centralt aspekt for ethvert kræftpræklinisk modelsystem er, at det skal efterligne humane fænotyper og rekapitulere både den genetiske heterogenitet og miljøet, der inkorporerer de mange stromale og immunpopulationer, der udgør TME. Derfor skal der tages hensyn til flere aspekter, når man vælger musemodeller til præklinisk forskning. For at undersøge tumorimmuninteraktionen kan histokompatible kræftcellelinjer injiceres i syngeneiske immunkompetente mus. I de fleste tilfælde injiceres disse subkutant i musens flanke, hvilket muliggør nem tumorovervågning ved palpation eller visuel inspektion. De resulterende modeller efterligner imidlertid ikke væksten af tumorceller i deres oprindelsesorgan. Derfor blev ortopiske transplantationer guldstandarden for allograftmodeller.
Musens ortotopiske allotransplantater har flere fordele: de er omkostningseffektive, kan genereres med en relativt enkel procedure og resulterer i modeller med kendt molekylær makeup samt en reproducerbar og forudsigelig tumorprogression og fænotype. Mens patientafledte xenograftmodeller repræsenterer adfærden hos humane PDAC-celler nøjagtigt, begrænser behovet for implantation i immundefekte mus for at undgå transplantatafstødning analysen af tumorimmun- og tumor-stroma-interaktionerne, hvilket gør det muligt for forskere kun at fange et delvist billede af kompleksiteten af disse tumorer. Syngeneiske ortotopiske allotransplantater af PDAC har også en fordel i denne henseende sammenlignet med genetisk manipulerede musemodeller (GEMM’er). GEMM’er rekapitulerer nøjagtigt human PDAC-tumorigenese og heterogeniteten observeret hos PDAC-patienter. På grund af disse funktioner kan GEMM-tumorer imidlertid vise høj varians i deres genetiske sammensætning, tumorprogression, aggressivitet, histologisk differentiering og TME-sammensætning. Selvom dette kan være en fordel i visse undersøgelser, begrænser det genotype-til-fænotype-undersøgelser og den fokuserede undersøgelse af PDAC-fænotyper13. Derfor udgør ortopiske allotransplantater med mus en god afvejning og model til at udføre tumorværts- og behandlingsundersøgelser in vivo. Dette papir skitserer en protokol for ortopiske transplantationseksperimenter af murine PDAC-celler i musebugspytkirtlen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ortotopiske transplantater med mus udgør en robust model for prækliniske undersøgelser på grund af deres omkostningseffektivitet, reproducerbarhed og relativt enkle eksperimentelle procedurer13,15. Disse modeller tillader ikke kun undersøgelse af tumor-værtsinteraktioner, men garanterer også bevarelsen af den genetiske heterogenitet af de tumorer, de stammer fra, når primære musecellekulturer anvendes til eksperimentet.
Denne …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke TUM dyrefacilitet og billeddannelse kernefacilitet af Institut for Nuklearmedicin, Klinikum rechts der Isar, for fremragende teknisk support. Denne undersøgelse blev støttet af det tyske kræftkonsortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 og S01) til D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 og 2017.091.2) til D.S. og Det Europæiske Forskningsråd (ERC CoG nr. 648521, til D.S.).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
