Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos
Summary
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.
Abstract
A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.
Introduction
O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto1. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado2. Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas3. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. O paradigma atual para a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de modelos animais. No entanto, as diferenças de espécies em relação ao uso de modelos animais são cada vez mais reconhecidas como a principal causa de previsões imprecisas para a cardiotoxicidade induzida por drogas em pacientes humanos4. Por exemplo, a morfologia do potencial de ação cardíaca difere substancialmente entre humanos e camundongos devido às contribuições de diferentes correntes de repolarização5. Além disso, isoformas diferenciais de miosina cardíaca e RNAs circulares que podem afetar a fisiologia cardíaca têm sido bem documentadas entre as espécies 6,7. Para preencher essas lacunas, é imperativo estabelecer um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca.
A invenção inovadora da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) gerou plataformas sem precedentes de triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Na última década, métodos para gerar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) tornaram-se bem estabelecidos 8,9. Os CM-hiPSC têm atraído grande interesse em suas potenciais aplicações na modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Por exemplo, os CM-hiPSC têm sido utilizados para modelar os fenótipos patológicos de doenças cardíacas causadas por herança genética, como a síndrome do QT longo10, a cardiomiopatia hipertrófica 11,12 e a cardiomiopatia dilatada13,14,15. Consequentemente, foram identificadas as principais vias de sinalização implicadas na patogênese das doenças cardíacas, o que pode lançar luz sobre possíveis estratégias terapêuticas para um tratamento eficaz. Além disso, os CM-hiPSC têm sido utilizados para rastrear a cardiotoxicidade induzida por drogas associada a agentes anticancerígenos, incluindo doxorrubicina, trastuzumabe e inibidores da tirosina quinase16,17,18; estratégias para mitigar a cardiotoxicidade resultante estão sob investigação. Por fim, a informação genética retida nas CME-hiPSC permite a triagem e a predição da cardiotoxicidade induzida por fármacos tanto em nível individual quanto populacional19,20. Coletivamente, os hiPSC-CMs provaram ser uma ferramenta inestimável para a previsão personalizada da segurança cardíaca.
O objetivo geral deste protocolo é estabelecer metodologias para investigar de forma abrangente e eficiente as características funcionais dos CM-hiPSC, que são de grande importância na aplicação de CMhiPSC para modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Aqui, detalhamos uma série de ensaios funcionais para avaliar as propriedades funcionais dos CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio (Ca2+) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Blake Wu pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW), e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
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