Выделение и количественная оценка вируса Эпштейна-Барра из клеточной линии P3HR1

Summary

Этот протокол позволяет выделять вирусные частицы Эпштейна-Барра из клеточной линии P3HR1 человека при индуцировании вирусного литического цикла форболом 12-миристатом 13-ацетатом. ДНК впоследствии извлекается из вирусного препарата и подвергается ПЦР в режиме реального времени для количественной оценки концентрации вирусных частиц.

Abstract

Вирус Эпштейна-Барра (EBV), официально обозначенный как вирус герпеса человека 4 (HHV-4), является первым изолированным опухолевым вирусом человека. Почти 90-95% взрослого населения мира инфицировано ВЭБ. С недавними достижениями в области молекулярной биологии и иммунологии применение экспериментальных моделей in vitro и in vivo обеспечило глубокое и значимое понимание патогенеза ВЭБ при многих заболеваниях, а также опухолегенеза, связанного с ВЭБ. Целью этого визуализированного экспериментального документа является предоставление обзора выделения вирусных частиц ВЭБ из клеток клеточной линии P3HR1 с последующей количественной оценкой вирусного препарата. Клетки P3HR1, первоначально выделенные из лимфомы Беркитта человека, могут продуцировать вирус P3HR1, который является штаммом ВЭБ типа 2. Литический цикл EBV может быть индуцирован в этих клетках P3HR1 путем обработки форболом 12-миристатом 13-ацетатом (PMA), давая вирусные частицы EBV.

Используя этот протокол для выделения частиц ВЭБ, клетки P3HR1 культивируют в течение 5 дней при 37 °C и 5% CO₂ в полной среде RPMI-1640, содержащей 35 нг/мл PMA. Впоследствии питательную среду центрифугируют со скоростью 120 х г в течение 8 мин для гранулирования клеток. Затем вируссодержащий супернатант собирают и прядут вниз со скоростью 16 000 х г в течение 90 мин, чтобы гранулировать частицы ВЭБ. Затем вирусная гранула повторно суспендируется в полной среде RPMI-1640. За этим следует экстракция ДНК и количественная ПЦР в режиме реального времени для оценки концентрации частиц ВЭБ в препарате.

Introduction

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) является первым опухолевым вирусом человека, который был выделен¹. EBV, формально называемый вирусом герпеса человека 4 (HHV-4)², является частью подсемейства вируса гамма-герпеса семейства вирусов герпеса и является прототипом рода Lymphocryptovirus . Почти 90-95% взрослого населения мира инфицировано вирусом³. В большинстве случаев первоначальная инфекция происходит в течение первых 3 лет жизни и протекает бессимптомно, однако, если инфекция происходит позже в подростковом возрасте, она может привести к заболеванию, называемому инфекционным мононуклеозом⁴. ВЭБ способен инфицировать покоящиеся В-клетки, побуждая их становиться пролиферативными В-лимфобластами, в которых вирус устанавливает и поддерживает латентно инфицированное состояние⁵. ВЭБ может реактивироваться в любое время и, таким образом, привести к рецидивирующим инфекциям⁶.

За последние 50 лет связь между некоторыми вирусами и развитием злокачественных новообразований человека становится все более очевидной, и сегодня, по оценкам, от 15% до 20% всех видов рака человека связаны с вирусными инфекциями⁷. Вирусы герпеса, включая ВЭБ, являются одними из наиболее изученных примеров этих типов опухолевых вирусов⁸. Фактически, ВЭБ может вызывать многие типы злокачественных новообразований человека, такие как лимфома Беркитта (BL), лимфома Ходжкина (HL), диффузная крупная В-клеточная лимфома и лимфопролиферативные заболевания у иммунокомпрометированных хозяев ^9,10. Было также показано, что ВЭБ связан с развитием системных аутоиммунных заболеваний. Некоторыми примерами этих аутоиммунных расстройств являются ревматоидный артрит (РА), полимиозит-дерматомиозит (PM-DM), системная красная волчанка (SLE), смешанное заболевание соединительной ткани (MCTD) и синдром Шегрена (SS)¹¹. ВЭБ также связан с развитием воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)¹².

Многие из этих заболеваний могут быть изучены или смоделированы с использованием клеточной культуры, мышей или других организмов, инфицированных ВЭБ. Вот почему частицы ВЭБ необходимы для заражения клеток или организмов, будь то in vitro или in vivo модели 13,14,15,16, отсюда необходимость разработки метода, который позволяет выделять вирусные частицы при низких затратах. Протокол, описанный здесь, предоставляет рекомендации по простому способу надежного выделения частиц ВЭБ из относительно доступной клеточной линии и количественного определения частиц с использованием ПЦР в режиме реального времени, которая является экономически эффективной и легко доступной для большинства лабораторий. Это по сравнению с несколькими другими методами, которые были описаны для выделения ВЭБ из различных клеточных линий 17,18,19,20.

P3HR-1 представляет собой клеточную линию BL, которая растет в суспензии и латентно инфицирована штаммом EBV типа 2. Эта клеточная линия является продуцентом ВЭБ и может быть индуцирована для производства вирусных частиц. Целью этой рукописи является демонстрация метода, который позволяет выделить частицы ВЭБ из клеточной линии P3HR-1 с последующей количественной оценкой вирусного запаса, который впоследствии может быть использован как для экспериментальных моделей ВЭБ in vitro , так и in vivo .

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: ВЭБ следует рассматривать как потенциально биологически опасный материал и, таким образом, следует рассматривать в рамках сдерживания уровня 2 биобезопасности или выше. Следует надеть лабораторное пальто, а также перчатки. Если существует вероятность воздействия брызг, сл…

Representative Results

Целью этой процедуры является выделение частиц ВЭБ в суспензии с известным вирусным титром, который впоследствии может быть использован для моделирования ВЭБ-инфекции. Таким образом, крайне важно использовать оптимальные концентрации различных реагентов для получения наибольшего в?…

Discussion

Производство частиц ВЭБ необходимо для понимания биологии этого вируса, а также связанных с ним заболеваний. Здесь мы описали производство этих частиц из клеточной линии P3HR-1. Эта клеточная линия не является единственной линией EBV-производителя; фактически, частицы ВЭБ также были выдел?…

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121