إعداد تعليق خلية غير عضلة القلب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من قلب الفأر البالغ بعد احتشاء عضلة القلب
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا لعزل كمية كافية من الخلايا العضلية غير القلبية المفردة ذات الصلاحية العالية من قلب الفأر بعد احتشاء عضلة القلب (MI). يمكن استخدام هذا لتسلسل الخلية الواحدة اللاحق ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، وزراعة الخلايا الأولية.
Abstract
احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، مع زيادة معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم. تمثل الخلايا غير القلبية أكثر من نصف إجمالي عدد خلايا القلب ، وتساهم في التعويضات التكيفية عند إصابة عضلة القلب ، بما في ذلك الاستجابات الالتهابية وإصلاح الأنسجة وتشكيل الندبات. لدراسة البيئة المكروية القلبية بعد MI ، يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) على نطاق واسع لتحديد أنواع خلايا القلب المختلفة والاتصالات بين الخلايا. من بين إجراءات تحضير عينة scRNA-seq ، يعد تحضير تعليق الخلية أحد أهم الخطوات ، لأن صلاحية الخلية يمكن أن تؤثر على جودة نتائج scRNA-seq. لذلك ، قمنا بتصميم بروتوكول تجريبي لإعداد تعليق الخلايا غير القلبية من قلوب الفئران بعد MI مع التركيز الإضافي على تحسين صلاحية الخلية عن طريق اختيار إنزيمات هضمية خفيفة ، والتحكم في وقت الهضم ، وتطبيق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). أخيرا ، قمنا بعزل خلايا CD45 + من تعليق الخلايا غير القلبية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول ، ثم أجرينا scRNA-seq.
Introduction
احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، ويزداد معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم1. يحدث MI بسبب عدم كفاية إمدادات الدم إلى عضلة القلب المحيطة ، والتي يمكن أن تكون نتيجة لانسداد الشريان التاجي الذي يحدث مع تمزق لوحة تصلب الشرايين. على الرغم من أن التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) قد قلل من معدلات وفيات مرضى MI الحاد ، إلا أن ارتفاع معدل انتشار قصور القلب بعد MI لا يزال يمثلمشكلة 2. الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية الكامنة وراء قصور القلب بعد MI هي استجابة الجسم التعويضية لإصابات القلب ، والتي تنطوي على استبدال عضلة القلب الميتة بندوب ليفية غير مقلصة. تعتمد هذه الاستجابات التكيفية بشكل كبير على الالتهاب الموضعي بوساطة التفاعلات بين أنواع الخلايا المتعددة وخلايا أنسجة القلب ، ويعتبر هذا الالتهاب الآن هدفا علاجيا محتملا لتقليل تكوين الندبة الليفية ، وبالتالي الحماية من قصور القلب بعد MI 3,4. ومن المثير للاهتمام أن البيئة المكروية في موقع الاحتشاء تشهد انتقالا يعتمد على الوقت في أنواع الخلايا المتسللة ووظائفها في مراحل مختلفة من MI 1,5. أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا غير القلبية (مثل الخلايا المناعية والخلايا الليفية والخلايا البطانية) تلعب أدوارا مركزية في التهاب ما بعد MI وإصلاح الأنسجة 5,6. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تسلسل الخلية الواحدة على نطاق واسع كأداة قوية لتوضيح مشاركات ووظائف الخلايا العضلية غير القلبية في البيئة الدقيقة بعد MI 7,8. يوفر هذا نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية لإصابة وإصلاح ما بعد MI وتطوير العلاجات المحتملة ضد قصور القلب بعد MI.
تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-Seq) هو تقنية تستخدم لدراسة النسخ الكاملة بتفصيل كبير باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) 7،8،9. في الآونة الأخيرة ، أحدث تطوير scRNA-Seq ثورة في مجال البحوث الطبية الحيوية. بالمقارنة مع التسلسل السائب التقليدي ، يحلل scRNA-Seq ملفات تعريف التعبير الجيني وعدم تجانس النسخ على مستوى الخليةالواحدة 7,8. تعزز هذه التقنية بشكل كبير البحث في الفيزيولوجيا المرضية الخلوية ل MI 9,10 من خلال تحديد أنواع الخلايا المتداولة المختلفة في البيئة المكروية بعد MI والكشف عن التفاعل بين خلايا عضلة القلب والخلايا العضلية غير القلبية. تساهم هذه النتائج أيضا في الكشف عن أهداف علاجية جديدة لفشل القلب بعد MI. بشكل عام ، تتضمن تجربة ما بعد MI القائمة على scRNA-seq ثلاثة أقسام رئيسية: (1) إنشاء نموذج حيواني بعد MI. (2) إعداد تعليق الخلية ؛ و (3) تسلسل العينات وتحليل البيانات. من الملاحظ أن تحضير تعليق الخلية هو الخطوة الأكثر أهمية في إعداد تجربة scRNA-Seq لأن جودة تعليق الخلية تحدد دقة النتائج.
تم تصميم هذا البروتوكول لاستخراج تعليق الخلايا غير القلبية من الأنسجة القلبية بعد MI. بشكل ملحوظ ، يتم تضمين التفاصيل المحددة للحفاظ على صلاحية الخلية وحلها. وفي الوقت نفسه ، يمكن العثور على المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول ، مثل المجموعات الجراحية للفئران وأجهزة تهوية القوارض وأجهزة الطرد المركزي ، في معظم مراكز التجارب على الحيوانات والمختبرات الطبية الحيوية ، وبالتالي ، فإن تكلفة تجربة هذا البروتوكول منخفضة نسبيا. علاوة على ذلك ، إذا تم النظر في النقاط الزمنية ومواقع الاحتشاء كمتغيرات ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمحاكاة مجموعة واسعة من السيناريوهات السريرية ، خاصة بالنسبة لمضاعفات ما بعد MI.
Protocol
Representative Results
Discussion
تهدف هذه المقالة إلى وصف بروتوكول لعزل الخلايا العضلية غير القلبية المفردة من قلوب الفئران بعد MI. يمكن تطبيق البروتوكول لعزل أنواع مختلفة من الخلايا في البيئة المكروية بعد MI بجودة عالية ، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا البطانية والخلايا الليفية. هناك ثلاثة عوامل أساسية حاسمة للحصو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل صناديق العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ (LQ22H020010).
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
