JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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면역학 및 감염병학

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

Abstract

선천성 면역은 병원균과 무균 모욕에 대응하여 중요한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 이 반응의 주요 기계적 구성 요소는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 면역 반응을 전파하기 위한 선천성 면역 프로그램 세포 사멸(PCD)의 시작입니다. 그러나 과도한 PCD는 염증 및 병리와 관련이 있습니다. 따라서 PCD의 활성화 및 조절을 이해하는 것은 선천성 면역 반응을 특성화하고 질병 스펙트럼 전반에 걸쳐 새로운 치료 표적을 식별하는 데 핵심적인 측면입니다.

이 프로토콜은 세포자멸사, 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis를 포함하는 다양한 PCD 경로와 종종 연관되는 시스테인 의존성 프로테아제 계열인 카스파제를 모니터링하여 선천성 면역 PCD 활성화를 특성화하는 방법을 제공합니다. 초기 보고서에서는 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10을 개시제 카스파제로, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7을 세포자멸사에서 이펙터 카스파제로 특성화한 반면, 이후 연구에서는 염증성 카스파제, 카스파제-1, 카스파제-4, 카스파제-5 및 카스파제-11이 파이롭토시스를 유발합니다. 이전에 정의된 PCD 경로 전반에 걸쳐 카스파제와 기타 선천성 면역 및 세포 사멸 분자 사이에 광범위한 누화가 있는 것으로 알려져 있으며, 선천성 면역 및 PCD에 대한 기계론적 이해에서 핵심 지식 격차를 식별하고 PANoptosis의 특성화로 이어집니다. PANoptosis는 다른 세포 사멸 경로에서 카스파제를 포함한 구성 요소를 통합하는 PANoptosome 복합체에 의해 조절되는 독특한 선천성 면역 염증 PCD 경로입니다.

여기서, 다양한 자극에 반응하여 카스파제의 활성화를 평가하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 활성화된 카스파제가 최적의 항체 및 블로팅 조건을 사용하여 웨스턴 블로팅으로 시각화할 수 있는 단백질 분해 절단을 거치기 때문에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 PCD 경로의 특성화를 허용합니다. 동일한 세포 집단에서 여러 카스파제의 활성화를 평가할 수 있는 프로토콜 및 웨스턴 블로팅 워크플로우가 확립되어 PCD 프로세스의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이 방법은 발달, 항상성, 감염, 염증 및 암의 연구 영역 전반에 걸쳐 적용하여 건강 및 질병의 세포 과정 전반에 걸쳐 PCD 경로를 평가할 수 있습니다.

Introduction

선천성 면역 체계는 감염 중 및 조직 손상 및 항상성 변화와 같은 무균 자극에 대한 반응으로 첫 번째 방어선 역할을 합니다. 세포 표면과 세포질의 선천성 면역 센서는 병원체 또는 손상 관련 분자 패턴(각각 PAMP 또는 DAMP)에 반응하여 염증 신호 전달 경로 및 세포 반응을 유발합니다. 선천성 면역 반응의 핵심 과정 중 하나는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 추가 선천성 및 적응성 면역 반응을 유도하기 위한 세포 사멸을 유도하는 것입니다. 프로그램된 세포 사멸(PCD)은 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 과정으로, 타고난 면역 메커니즘으로서의 진화적 중요성을 강조합니다.

모든 세포 유형에서 활성화될 수 있는 몇 가지 선천성 면역 PCD 경로가 있습니다. 카스파제는 고도로 보존된 세포내 시스테인 의존성 프로테아제의 핵심 계열로, 전통적으로 비염증성 세포자멸사 경로뿐만 아니라 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis와 같은 염증성 PCD 경로를 포함한 많은 PCD 경로에서 중요합니다 1,2,3,4,5 . 잘 정의 된 11 개의 인간 카스파제와 10 개의 뮤린 카스파제뿐만 아니라 기능적 일 수있는 유사 카스파제가 있으며, 대부분은 활성화를 위해 절단을 필요로하는 비활성 단량체 또는 이량체 프로 카스파제로 구성 적으로 표현됩니다 6,7. 카스파제는 또한 다단백질 복합체의 모집 및 형성을 위한 중요한 영역을 포함합니다. 여기에는 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-9 및 카스파제-11에서 찾을 수 있는 카스파아제 활성화 및 모집 도메인(CARD) 또는 카스파제-8 및 카스파제-10에서 발견되는 사멸 이펙터 도메인(DED)이 포함됩니다. 단백질 분해 활성과 다단백질 복합체 형성 능력을 통해 카스파제는 선천성 면역 PCD의 중요한 동인입니다.

선천성 면역 PCD에서 카스파제의 역할은 세포자멸사에서 처음 확인되었으며, 개시제 카스파제, 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10이 사형집행자 카스파제, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7을 활성화시켜 세포 사멸을 유도합니다 8,9,10,11,12. 개시제 카스파제는 다양한 신호 캐스케이드에 의해 활성화될 수 있습니다. 외인성 경로는 세포외 리간드 유도 사멸 수용체 신호전달을 통해 카스파제-8을 활성화시키고, 내인성 경로는 미토콘드리아 완전성의 파괴를 통해 카스파제-9를 활성화한다13. 활성화된 개시제 카스파제는 링커를 절단하여 사형집행인 카스파제의 크고 작은 촉매 서브유닛을 분리하여 활성 형태를 생성합니다. 그런 다음 사형 집행인 카스파제는 기질을 쪼개어 세포를 분해하여 DNA 분해, 막 블레빙, 핵 단편화 및 세포자멸사 방출을 초래합니다14,15. 이 과정은 전형적으로 비용해성 및 비염증성 형태의 세포 사멸로 끝나며, 이는 efferocytosis에 의한 죽어가는 세포의 즉각적인 제거와 결합될 때 이루어진다16. 그러나, efferocytosis의 결함 또는 식세포의 부족은 세포 사멸 세포의 축적으로 이어질 수 있으며, 이는 용해 및 염증 세포 사멸을 겪는다17,18.

카스파제-1(인간 및 마우스), 카스파제-4 및 카스파제-5(인간), 카스파제-11(마우스)을 포함한 염증성 카스파제는 파이롭토시스라고 하는 염증성 선천성 면역 PCD(III-PCD)의 한 형태 동안 활성화되는 것으로 밝혀졌습니다. 카스파제-1 활성화는 세포질 선천성 면역 센서, 어댑터 분자(CARD[ASC]를 포함하는 세포자멸사 관련 반점 유사 단백질) 및 카스파제-1을 포함하는 다단백질 복합체인 인플라마솜의 형성과 관련이 있습니다. 이 복합체의 형성은 카스파제-1이 근접 매개 자가단백질 분해를 거쳐 활성 형태를 방출할 수 있도록 하며, 이는 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-1β 및 IL-18과 기공 형성 분자 gasdermin D(GSDMD)19,20,21,22,23를 포함한 표적 기질을 절단할 수 있습니다 . 카스파제-11, 카스파제-4 및 카스파제-5는 또한 지질다당류(LPS)19,20와 같은 PAMP를 감지한 후 인플라마솜의 상류 형성 없이 GSDMD를 활성화할 수 있습니다. 이들 카스파제는 이량체화에 이어 세포질 LPS에 결합할 때 활성화를 위한 올리고머화 및 자가절단을 거치며, 이는 IL-1β 및 IL-18 성숙을 유도하기 위해 세포 내재적 방식으로 비정준 인플라마좀 활성화 24,25,26 및 카스파제-1 활성화를 유도한다 20. 이러한 전염증성 사이토카인의 성숙과 방출은 이러한 카스파제를 “염증성”으로 특징짓습니다. 또한, 아폽토시스 카스파제-8은 인플라마솜에 국한되어 아폽토시스와 파이롭토시스 과정 사이의 연관성을 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 연구에 따르면 아폽토시스 카스파제-8은 괴사라고 하는 또 다른 형태의 PCD를 조절하는 데에도 중요합니다. 카스파제-8의 손실은 자발적인 수용체 상호작용 세린-트레오닌 키나아제 3(RIPK3) 매개 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 슈도키나아제(MLKL) 활성화를 초래하여 괴사 27,28,29,30,31,32,33,34,35의 III-PCD 경로를 구동합니다.

카스파제는 역사적으로 카스파제에서 발생하는 세포 사멸 유형에 따라 “세포사멸” 또는 “염증성”으로 분류되어 왔지만, 카스파제를 통한 선천성 면역 PCD 경로 사이에 광범위한 혼선이 있음을 시사하는 증거가 늘어나고 있습니다 3,4. 예를 들어, inflammasomes의 염증성 카스파제-1은 표준 활성화 부위34에서 세포사멸 카스파제-7을 절단합니다. 카스파제-1 활성화는 또한 폴리(ADP-리보스) 중합효소 1 (PARP1)36과 같은 아폽토시스 기질의 절단을 유도할 수 있다. GSDMD가 결핍된 세포에서 카스파제-1은 또한 카스파제-337,38을 절단할 수 있습니다. 추가적으로, 정준적으로 아폽토시스 카스파제-3은 가스더민 E(GSDME)를 절단하여 PCD17,18을 유도할 수 있고, 또한 GSDMD를 비활성 형태40으로 처리할 수 있다. 또한, 인플라마좀 복합체에 대한 카스파제-8 모집은 39,40,41,42,43,44,45로 관찰되었으며, 카스파제-8은 정준 및 비정준 인플라마좀 활성화의 핵심 조절자이다 39. 또한 많은 염증 조건에서 카스파제-8 및 카스파제-1에 대한 중복되고 중복된 역할이 존재하며, 발열, 세포사멸 및 괴사 성분의 활성화를 특징으로 하는 선천성 면역 PCD는 질병 스펙트럼 39,46,47,48,49,50에 걸쳐 발생합니다.

염증성 카스파제와 세포자멸사 카스파제 사이의 이러한 혼선을 기반으로 선천성 면역과 PCD에 대한 기계론적 이해의 주요 격차가 확인되어 PANoptosis의 발견으로 이어졌습니다. PANoptosis는 병원체, PAMP, DAMP 및 항상성의 변화에 반응하여 활성화되는 독특한 형태의 III-PCD이며 다른 세포 사멸 경로의 구성 요소를 통합하는 다면적 거대분자 복합체인 PANoptosomes에 의해 조절됩니다 44,50,51,52,53,54,55 . PANoptosis는 카스파제-1, 카스파제-11, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-3 및/또는 카스파제-7을 포함한 다중 카스파제의 활성화를 특징으로 하기 때문에 PANoptosis에서 생물학적 효과의 총체는 pyroptosis, apoptosis또는 necroptosis 단독으로 개별적으로 설명될 수 없습니다 3,4,35,36,39,46,47,48, 문맥에 따라 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis는 감염성 및 염증성 질환뿐만 아니라 암 및 암 치료법에 점점 더 연루되어 왔습니다 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

세포자멸사, 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis를 포함한 세포 사멸 경로 전반에 걸쳐 카스파제의 필수적인 역할을 감안할 때, 카스파제의 활성화를 특성화하고 PCD 경로의 전체 복잡성을 이해하는 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 세포를 자극하고 카스파제의 후속 활성화를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다(그림 1). 이 방법은 일반적으로 활성화에 필요한 카스파제의 단백질 분해 절단을 연구 수단으로 활용합니다. 웨스턴 블로팅을 통해 단백질 크기를 측정할 수 있으며, 이를 통해 비활성 프로카스파제와 활성화된 절단 형태를 명확하게 시각화하고 구별할 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 이점은 1) PCD 활성화를 보다 정확하게 결정하기 위해 내인성 세포의 단일 집단에서 병렬로 여러 카스파제의 활성화를 평가하는 능력과 2) 광범위한 교육이나 값비싼 장비가 필요하지 않은 비교적 간단한 실험실 기술의 사용입니다. 이전 프로토콜은 배양 상층액, 세포 및 조직 용해물, 현미경을 통한 전체 세포 및 생체 내 67,68,69,70,71에서 카스파아제 활성화를 모니터링하기 위해 웨스턴 블로팅, 형광 리포터 또는 항체 염색을 사용했지만 이러한 기술은 일반적으로 샘플에서 하나 또는 두 개의 카스파제만 모니터링합니다. 또한, 절단 시 형광을 발하는 카스파제 절단 부위를 함유하는 합성 펩타이드 기질이 세포 또는 조직 용해물에서 카스파제 활성화를 모니터링하기 위해 사용되어 왔지만(69), 이들 기질은 종종 하나 이상의 카스파제에 의해 절단될 수 있어, 이 시스템에서 개별 카스파제의 특이적 활성화를 결정하기 어렵게 만든다. 또한 형광 리포터 또는 기타 태그 기반 방법을 사용하는 대신 웨스턴 블로팅을 사용하면 연구자가 리포터 유전자로 특정 세포주를 만드는 대신 내인성 세포를 사용할 수 있습니다. 내인성 세포를 사용하는 데에는 많은 불멸화 된 세포주가 주요 세포 사멸 분자72,73이 결핍되어 결과에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 포함하여 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 내인성 세포를 사용하면 단일 계통이 아닌 대식세포, 상피 세포 및 내피 세포와 같은 다양한 세포 유형을 평가할 수 있습니다. 웨스턴 블로팅은 또한 크고 값비싼 장비나 복잡한 설정 없이 전 세계 실험실에서 수행할 수 있는 비교적 간단하고 비용 효율적인 기술입니다.

이 프로토콜은 다른 염증 신호 전달 경로에서의 스캐폴딩 역할 및 기능을 포함하여 카스파제의 세포 사멸 의존성 및 세포 사멸 비의존적 기능을 모두 이해하기 위해 생물학 전반에 걸쳐 광범위하게 적용할 수 있습니다74. 이 방법을 적용하면 질병 및 상태 전반에 걸친 선천성 면역 PCD 경로 및 염증 신호 연구에서 통합된 접근 방식이 가능하며, 이 프로토콜은 미래 치료 전략의 개발을 알릴 중요한 조절 과정과 기계론적 연결을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

동물 사용 및 절차는 동물 사용 및 관리에 관한 세인트 주드 아동 연구 병원 위원회의 승인을 받았습니다. 1. 솔루션 준비 L929 컨디셔닝 미디어를 준비합니다.플레이트 1 ×10 6 개의 L929 세포 ( 재료의 표 참조)를 50 mL의 L929 배양 배지를 함유하는 182cm2 조직 배양 플라스크 (배지의 제조에 대해서는 표 1 참조)에 ?…

Representative Results

PANoptosis는 수많은 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 감염 및 기타 염증 자극뿐만 아니라 암세포에서도관찰되었습니다 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <sup class="xref…

Discussion

카스파제 절단 및 활성화를 모니터링하면 선천성 면역 반응의 일부로서 선천성 면역 PCD 활성화에 대한 가장 포괄적인 사진 중 하나를 얻을 수 있습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 IAV, HSV1 및 F. novicida 감염 및 멸균 트리거 LPS + ATP에 대한 반응으로 카스파제 활성화를 모니터링하는 전략을 보여주지만, 다수의 다른 자극이 PCD를 유도할 수 있고, 여러 간행물 44,48,49,50,51,52,53,54,56에 <sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

의견과 제안을 해주신 Kanneganti 연구실 구성원들에게 감사드리며, 과학 편집 지원을 해주신 J. Gullett 박사님께도 감사드립니다. 우리 연구실의 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 및 CA253095 (T.-D.K.) 및 미국 레바논 시리아 연합 자선 단체 (T.-D.K.). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
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References

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Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
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