Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées
Summary
Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.
Abstract
L’immunité innée fournit la première ligne de défense critique en réponse aux agents pathogènes et aux insultes stériles. Un élément mécaniste clé de cette réponse est l’initiation de la mort cellulaire programmée immunitaire innée (DCP) pour éliminer les cellules infectées ou endommagées et propager les réponses immunitaires. Cependant, l’excès de DCP est associé à une inflammation et à une pathologie. Par conséquent, la compréhension de l’activation et de la régulation de la DCP est un aspect central de la caractérisation des réponses immunitaires innées et de l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques à travers le spectre de la maladie.
Ce protocole fournit des méthodes pour caractériser l’activation immunitaire innée de la DCP en surveillant les caspases, une famille de protéases dépendantes de la cystéine qui sont souvent associées à diverses voies de PCD, y compris l’apoptose, la pyroptose, la nécroptose et la panoptique. Les rapports initiaux ont caractérisé la caspase-2, la caspase-8, la caspase-9 et la caspase-10 comme caspases initiatrices et la caspase-3, la caspase-6 et la caspase-7 comme caspases effectrices dans l’apoptose, tandis que des études ultérieures ont trouvé les caspases inflammatoires, caspase-1, caspase-4, caspase-5 et caspase-11, entraîner la pyroptose. On sait maintenant qu’il existe une diaphonie étendue entre les caspases et d’autres molécules immunitaires et de mort cellulaire innées à travers les voies de DCP précédemment définies, identifiant une lacune clé dans la compréhension mécaniste de l’immunité innée et de la DCP et conduisant à la caractérisation de PANoptosis. PANoptosis est une voie inflammatoire innée unique de PCD inflammatoire innée régulée par les complexes PANoptosomes, qui intègrent des composants, y compris des caspases, provenant d’autres voies de mort cellulaire.
Ici, des méthodes pour évaluer l’activation des caspases en réponse à divers stimuli sont fournies. Ces méthodes permettent de caractériser les voies de DCP in vitro et in vivo, car les caspases activées subissent un clivage protéolytique qui peut être visualisé par Western blot à l’aide d’anticorps et de conditions de buvard optimaux. Un protocole et un flux de travail de transfert Western ont été établis pour permettre l’évaluation de l’activation de plusieurs caspases de la même population cellulaire, fournissant une caractérisation complète des processus de DCP. Cette méthode peut être appliquée dans tous les domaines de recherche du développement, de l’homéostasie, de l’infection, de l’inflammation et du cancer pour évaluer les voies de la DCP tout au long des processus cellulaires de la santé et de la maladie.
Introduction
Le système immunitaire inné agit comme première ligne de défense pendant l’infection et en réponse à des stimuli stériles, tels que des lésions tissulaires et des altérations de l’homéostasie. Les capteurs immunitaires innés à la surface des cellules et dans le cytoplasme répondent aux schémas moléculaires associés aux agents pathogènes ou aux dommages (PAMP ou DAMP, respectivement) pour déclencher des voies de signalisation inflammatoires et des réponses cellulaires. L’un des processus clés de la réponse immunitaire innée est l’induction de la mort cellulaire pour éliminer les cellules infectées ou endommagées et stimuler d’autres réponses immunitaires innées et adaptatives. La mort cellulaire programmée (DCP) est un processus hautement conservé à travers les espèces, soulignant son importance évolutive en tant que mécanisme immunitaire inné.
Il existe plusieurs voies immunitaires innées de PCD qui peuvent être activées dans tous les types de cellules. Les caspases sont une famille clé de protéases hautement conservées, intracellulaires et dépendantes de la cystéine qui sont essentielles dans de nombreuses voies de DCP, y compris la voie de l’apoptose traditionnellement non inflammatoire, ainsi que les voies inflammatoires de DCP telles que la pyroptose, la nécroptose et la panoptique 1,2,3,4,5 . Il y a 11 caspases humaines et 10 caspases murines qui sont bien définies, ainsi que des pseudo-caspases qui peuvent être fonctionnelles, et la plupart sont constitutivement exprimées en pro-caspases monomères ou dimères inactives qui nécessitent un clivage pour l’activation 6,7. Les caspases contiennent également des domaines importants pour le recrutement et la formation de complexes multiprotéiques. Il s’agit notamment du domaine d’activation et de recrutement des caspases (CARD), qui peut être trouvé dans la caspase-1, la caspase-2, la caspase-4, la caspase-5, la caspase-9 et la caspase-11, ou le domaine effecteur de la mort (DED), qui se trouve dans la caspase-8 et la caspase-10. Grâce à leur activité protéolytique et à leur capacité à former des complexes multiprotéiques, les caspases sont des moteurs essentiels de la DCP immunitaire innée.
Le rôle des caspases dans la PCD immunitaire innée a été identifié pour la première fois dans l’apoptose, où les caspases initiatrices, caspases-2, caspases-8, caspases-9 et caspases-10, activent les caspases bourreaux, caspase-3, caspase-6 et caspase-7, pour conduire la mort cellulaire 8,9,10,11,12. Les caspases initiatrices peuvent être activées par diverses cascades de signalisation; La voie extrinsèque active la caspase-8 par la signalisation du récepteur de mort induite par un ligand extracellulaire, et la voie intrinsèque active la caspase-9 par la perturbation de l’intégrité mitochondriale13. Les caspases initiatrices activées clivent le linker séparant les grandes et les petites sous-unités catalytiques des caspases bourreaux pour produire leurs formes actives. Les caspases bourreaux clivent ensuite leurs substrats pour désassembler la cellule, ce qui entraîne une dégradation de l’ADN, un blebbing de la membrane, une fragmentation nucléaire et la libération de corps apoptotiques14,15. Ce processus se termine généralement par une forme non lytique et non inflammatoire de mort cellulaire lorsqu’il est associé à la clairance immédiate des cellules mourantes par efférocytose16. Cependant, des défauts d’efférocytose ou un manque de cellules phagocytaires peuvent entraîner l’accumulation de cellules apoptotiques, qui subissent alors la mort cellulaire lytique et inflammatoire17,18.
Les caspases inflammatoires, y compris la caspase-1 (humaine et souris), la caspase-4 et la caspase-5 (humaine) et la caspase-11 (souris), ont été découvertes pour être activées au cours d’une forme de PCD immunitaire innée inflammatoire (III-PCD) appelée pyroptose. L’activation de la caspase-1 est associée à la formation d’inflammasomes, qui sont des complexes multiprotéiques contenant un capteur immunitaire inné cytosolique, une molécule adaptatrice (protéine de type speck associée à l’apoptose contenant un CARD [ASC]) et de la caspase-1. La formation de ce complexe permet à la caspase-1 de subir une autoprotéolyse médiée par la proximité pour libérer sa forme active, qui peut cliver les substrats cibles, y compris les cytokines pro-inflammatoires interleukine (IL)-1β et IL-18 et la molécule formant des pores gasdermine D (GSDMD)19,20,21,22,23 . La caspase-11, la caspase-4 et la caspase-5 peuvent également activer la GSDMD sans la formation en amont de l’inflammasome après avoir détecté des PAMP tels que le lipopolysaccharide (LPS)19,20. Ces caspases subissent une dimérisation suivie d’une oligomérisation et d’un auto-clivage pour activation lors de la liaison au LPS cytosolique, ce qui conduit à l’activation non canonique de l’inflammasome 24,25,26 et à l’activation de la caspase-1 de manière cellulaire intrinsèque pour induire la maturation de l’IL-1β et de l’IL-18 20. La maturation et la libération de ces cytokines pro-inflammatoires caractérisent ces caspases comme « inflammatoires ». De plus, la caspase-8 apoptotique s’est localisée dans l’inflammasome, fournissant un lien entre les processus apoptotiques et pyroptotiques. Des études ont montré que la caspase-8 apoptotique est également essentielle pour réguler une autre forme de DCP appelée nécroptose. La perte de caspase-8 entraîne une activation spontanée de la pseudokinase mixte de type domaine de la lignée kinase 3 (RIPK3) médiée par la sérine-thréonine kinase (MLKL) pour piloter la voie III-PCD de nécroptose27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Alors que les caspases ont toujours été classées comme « apoptotiques » ou « inflammatoires » en fonction du type de mort cellulaire qu’elles initient, de plus en plus de preuves suggèrent qu’il existe une diaphonie étendue entre les voies immunitaires innées de PCD à travers les caspases 3,4. Par exemple, la caspase-1 inflammatoire des inflammasomes clive la caspase-7 apoptotique à son site d’activation canonique34. L’activation de la caspase-1 peut également entraîner le clivage de substrats apoptotiques tels que la poly(ADP-ribose) polymérase 1 (PARP1)36. Dans les cellules dépourvues de GSDMD, la caspase-1 peut également cliver la caspase-337,38. De plus, la caspase-3 canoniquement apoptotique peut cliver la gasdermine E (GSDME) pour induire la DCP17,18 et transforme également la GSDMD en une forme inactive40. De plus, le recrutement de caspase-8 dans le complexe inflammasome a été observé 39,40,41,42,43,44,45, et la caspase-8 est un régulateur clé de l’activation canonique et non canonique de l’inflammasome 39. Il existe également des rôles chevauchants et redondants pour la caspase-8 et la caspase-1 dans de nombreuses conditions inflammatoires, et la PCD immunitaire innée caractérisée par l’activation de composants pyroptotiques, apoptotiques et nécroptotiques se produit dans tout le spectre de la maladie 39,46,47,48,49,50.
Sur la base de cette diaphonie entre les caspases inflammatoires et apoptotiques, une lacune clé dans la compréhension mécaniste de l’immunité innée et de la DCP a été identifiée, conduisant à la découverte de PANoptosis. PANoptosis est une forme unique de III-PCD qui est activée en réponse aux agents pathogènes, PAMPs, DAMP et altérations de l’homéostasie et est régulée par les PANoptosomes – complexes macromoléculaires multifacettes qui intègrent des composants d’autres voies de mort cellulaire 44,50,51,52,53,54,55 . La totalité des effets biologiques de PANoptosis ne peut pas être expliquée individuellement par la pyroptose, l’apoptose ou la nécroptose seule 3,4,35,36,39,46,47,48, car PANoptosis est caractérisée par l’activation de plusieurs caspases, y compris la caspase-1, la caspase-11, la caspase-8, la caspase-9, la caspase-3 et/ou la caspase-7, selon le contexte 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis a été de plus en plus impliqué dans les maladies infectieuses et inflammatoires, ainsi que dans les cancers et les thérapies anticancéreuses 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Compte tenu du rôle essentiel des caspases dans les voies de mort cellulaire, y compris dans l’apoptose, la pyroptose, la nécroptose et la panoptique, il est important de développer des techniques pour caractériser leur activation et comprendre toute la complexité des voies de DCP. Le protocole détaille ici une méthode pour stimuler les cellules et mesurer l’activation ultérieure des caspases (Figure 1). Cette méthode exploite le clivage protéolytique des caspases, qui est généralement nécessaire à leur activation, comme moyen de les étudier. Grâce au Western blotting, la taille des protéines peut être déterminée, ce qui permet de visualiser et de différencier clairement les pro-caspases inactives et leurs formes activées et clivées.
Les principaux avantages de ce protocole sont 1) sa capacité à évaluer l’activation de plusieurs caspases en parallèle à partir d’une seule population de cellules endogènes pour déterminer plus précisément l’activation des DCP et 2) l’utilisation de techniques de laboratoire relativement simples qui ne nécessitent pas de formation approfondie ou d’équipement coûteux. Les protocoles précédents ont utilisé le transfert Western, les rapporteurs fluorescents ou la coloration par anticorps pour surveiller l’activation des caspases dans les surnageants de culture, les lysats cellulaires et tissulaires, les cellules entières par microscopie et in vivo 67,68,69,70,71, mais ces techniques ne surveillent généralement qu’une ou deux caspases dans un échantillon. De plus, alors que des substrats peptidiques synthétiques contenant des sites de clivage de caspases fluorescentes lors du clivage ont été utilisés pour surveiller l’activation des caspases dans les lysats cellulaires ou tissulaires69, ces substrats peuvent souvent être clivés par plus d’une caspase, ce qui rend difficile la détermination de l’activation spécifique des caspases individuelles dans ce système. De plus, l’utilisation du Western blot plutôt que l’utilisation de rapporteurs fluorescents ou d’autres méthodes basées sur des marqueurs permet aux chercheurs d’utiliser des cellules endogènes plutôt que de créer des lignées cellulaires spécifiques avec des gènes rapporteurs. L’utilisation de cellules endogènes présente de multiples avantages, notamment le fait que de nombreuses lignées cellulaires immortalisées sont déficientes en molécules clés de mort cellulaire72,73, ce qui pourrait affecter les résultats. De plus, l’utilisation de cellules endogènes permet d’évaluer divers types de cellules, telles que les macrophages, les cellules épithéliales et les cellules endothéliales, plutôt qu’une seule lignée. Le Western blot est également une technique relativement simple et rentable qui peut être réalisée dans des laboratoires du monde entier sans avoir besoin de gros équipements coûteux ou de configurations compliquées.
Ce protocole est largement applicable à travers la biologie pour comprendre à la fois les fonctions dépendantes de la mort cellulaire et indépendantes de la mort cellulaire des caspases, y compris leurs rôles d’échafaudage et leurs fonctions dans d’autres voies de signalisation inflammatoires74. L’application de cette méthode permet une approche unifiée dans l’étude des voies immunitaires innées de la DCP et de la signalisation inflammatoire à travers les maladies et les affections, et ce protocole peut être utilisé pour identifier les processus de régulation critiques et les connexions mécanistes qui éclaireront le développement de futures stratégies thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La surveillance du clivage et de l’activation des caspases fournit l’une des images les plus complètes de l’activation immunitaire innée de la DCP dans le cadre de la réponse immunitaire innée. Le protocole décrit ici démontre une stratégie de surveillance de l’activation des caspases en réponse aux infections IAV, HSV1 et F. novicida et au déclencheur stérile LPS + ATP, mais de nombreux autres stimuli peuvent induire la DCP et pourraient être utilisés dans cette méthode, comme cela a été …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Kanneganti pour leurs commentaires et suggestions, et nous remercions J. Gullett, Ph.D., pour son soutien à l’édition scientifique. Le travail dans notre laboratoire est soutenu par les subventions AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 et CA253095 (à T.-D.K.) des National Institutes of Health (NIH) et par les American Lebanese Syrian Associated Charities (à T.-D.K.). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
Materials
| 0.45 μm filter | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 12% polyacrylamide gel with 10 wells | Bio-Rad | 4561043 | |
| 12-well plate | Corning | 07-200-82 | |
| 18 G needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 25 G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 50 mL tube | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Corning | 430597 | |
| 182-cm2 tissue culture flask | Genesee Scientific | 25-211 | |
| Accessory white trans tray | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti–caspase-1 antibody | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| Anti–caspase-11 antibody | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| Anti–caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| Anti–caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| Anti–caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 4927 | |
| Anti–caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | 9504 | |
| Anti–cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Anti–cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9491 | |
| Anti–cleaved caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
| Anti–β-Actin antibody (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL Trypticase Soy Broth | BD Biosciences | 211768 | |
| Bead bath | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| Bromophenol blue | Sigma | BO126 | |
| Cell scrapers | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
| Chemiluminescence imager (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 chamber | VetEquip | 901703 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| Eelectrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1658004 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1620 | |
| Filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Francisella novicida (U112 strain) | BEI Resources | NR-13 | |
| Gel releaser | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| Herpes simplex virus 1 (HF strain) | ATCC | VR-260 | |
| High glucose DMEM | Sigma | D6171 | |
| Human anti–caspase-1 antibody | R&D Systems | MAB6215 | |
| Human anti–caspase-8 antibody | Enzo | ALX-804-242 | |
| Humidified incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Image analysis software | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | constructed per Hoffmann et al. | ||
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | cell line for creating L929-conditioned media |
| L-cysteine | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUF0500 | standard-sensitivity HRP substrate |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | cell line for determining IAV viral titer |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Nonfat dried milk powder | Kroger | ||
| NP-40 solution | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| Power source | Bio-Rad | 164-5052 | |
| Protease inhibitor tablet | Sigma | S8820 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Rocking shaker | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| Super Signal Femto HRP substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | high-sensitivity HRP substrate |
| Tabletop centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| Trans-Blot semi-dry system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Tris | Sigma | TRIS-RO | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | cell line for determining HSV1 viral titer |
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