JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Оценка активации каспазы для оценки гибели врожденных иммунных клеток

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

В этом протоколе описывается комплексный метод оценки активации каспазы (каспаза-1, каспаза-3, каспаза-7, каспаза-8, каспаза-9 и каспаза-11) в ответ на модели инфекции, стерильных инсультов и рака in vitro и in vivo (у мышей) для определения инициации путей гибели клеток, таких как пироптоз, апоптоз, некроптоз и паноптоз.

Abstract

Врожденный иммунитет обеспечивает критическую первую линию защиты в ответ на патогены и стерильные оскорбления. Ключевым механистическим компонентом этого ответа является инициация врожденной иммунной запрограммированной клеточной смерти (PCD) для устранения инфицированных или поврежденных клеток и распространения иммунных ответов. Однако избыток PCD связан с воспалением и патологией. Таким образом, понимание активации и регуляции PCD является центральным аспектом характеристики врожденных иммунных реакций и выявления новых терапевтических мишеней по всему спектру заболевания.

Этот протокол предоставляет методы для характеристики активации врожденного иммунитета PCD путем мониторинга каспаз, семейства цистеин-зависимых протеаз, которые часто связаны с различными путями PCD, включая апоптоз, пироптоз, некроптоз и PANoptosis. Первоначальные отчеты характеризовали каспазу-2, каспазу-8, каспазу-9 и каспазу-10 как инициирующие каспазы, а каспазу-3, каспазу-6 и каспазу-7 как эффекторные каспазы при апоптозе, в то время как более поздние исследования показали, что воспалительные каспазы, каспаза-1, каспаза-4, каспаза-5 и каспаза-11, вызывают пироптоз. В настоящее время известно, что существует обширная перекрестная связь между каспазами и другими молекулами врожденного иммунитета и клеточной смерти по ранее определенным путям ПХД, что выявляет ключевой пробел в знаниях в механистическом понимании врожденного иммунитета и ПМД и приводит к характеристике ПАНоптоза. PANoptosis – это уникальный врожденный иммунный воспалительный путь PCD, регулируемый комплексами PANoptosome, которые объединяют компоненты, в том числе каспазы, из других путей гибели клеток.

Здесь приведены методы оценки активации каспаз в ответ на различные раздражители. Эти методы позволяют охарактеризовать пути ПХД как in vitro, так и in vivo, поскольку активированные каспазы подвергаются протеолитическому расщеплению, которое может быть визуализировано с помощью вестерн-блоттинга с использованием оптимальных антител и условий блоттинга. Был разработан протокол и рабочий процесс вестерн-блоттинга, которые позволяют оценить активацию нескольких каспаз из одной и той же клеточной популяции, обеспечивая всестороннюю характеристику процессов ПМД. Этот метод может применяться во всех областях исследований в области развития, гомеостаза, инфекции, воспаления и рака для оценки путей PCD на протяжении клеточных процессов в здоровье и болезнях.

Introduction

Врожденная иммунная система действует как первая линия защиты во время инфекции и в ответ на стерильные раздражители, такие как повреждение тканей и изменения гомеостаза. Врожденные иммунные датчики на поверхности клетки и в цитоплазме реагируют на молекулярные паттерны, связанные с патогеном или повреждением (PAMP или DAMP, соответственно), чтобы вызвать воспалительные сигнальные пути и клеточные реакции. Одним из ключевых процессов врожденного иммунного ответа является индукция гибели клеток для удаления инфицированных или поврежденных клеток и стимулирования дальнейших врожденных и адаптивных иммунных реакций. Запрограммированная гибель клеток (PCD) является высококонсервативным процессом у разных видов, что подчеркивает его эволюционное значение как врожденного иммунного механизма.

Существует несколько врожденных иммунных путей PCD, которые могут быть активированы во всех типах клеток. Каспазы являются ключевым семейством высококонсервативных, внутриклеточных, цистеин-зависимых протеаз, которые имеют решающее значение для многих путей ПХД, включая традиционно невоспалительный путь апоптоза, а также воспалительные пути ПХД, такие как пироптоз, некроптоз и ПАНоптоз 1,2,3,4,5 . Существует 11 каспаз человека и 10 мышиных каспаз, которые хорошо определены, а также псевдокаспазы, которые могут быть функциональными, и большинство из них конститутивно экспрессируются в виде неактивных мономерных или димерных прокаспаз, которые требуют расщепления для активации 6,7. Каспазы также содержат важные домены для рекрутирования и образования мультибелковых комплексов. К ним относятся домен активации и рекрутирования каспазы (CARD), который можно найти в каспазе-1, каспазе-2, каспазе-4, каспазе-5, каспазе-9 и каспазе-11, или эффекторный домен смерти (DED), который обнаружен в каспазе-8 и каспазе-10. Благодаря своей протеолитической активности и способности образовывать мультибелковые комплексы, каспазы являются критическими драйверами врожденного иммунного PCD.

Роль каспаз во врожденном иммунном PCD была впервые определена при апоптозе, где инициирующие каспазы, каспазы-2, каспазы-8, каспазы-9 и каспазы-10, активируют каспазы-палача, каспазу-3, каспазу-6 и каспазу-7, чтобы вызвать гибель клеток 8,9,10,11,12. Инициирующие каспазы могут активироваться различными сигнальными каскадами; Внешний путь активирует каспазу-8 посредством передачи сигналов рецептора смерти, индуцированного внеклеточным лигандом, а внутренний путь активирует каспазу-9 через нарушение целостности митохондрий13. Активированные инициирующие каспазы расщепляют линкер, разделяющий большие и малые каталитические субъединицы каспаз палачей, с образованием их активных форм. Затем каспазы палача расщепляют свои субстраты, чтобы разобрать клетку, что приводит к деградации ДНК, блеббингу мембраны, фрагментации ядра и высвобождению апоптотических тел14,15. Этот процесс обычно заканчивается нелитической и невоспалительной формой гибели клеток в сочетании с немедленным клиренсом умирающих клеток путем эффероцитоза16. Однако дефекты эффероцитоза или недостаток фагоцитарных клеток могут привести к накоплению апоптотических клеток, которые затем подвергаются литической и воспалительной гибеликлеток 17,18.

Было обнаружено, что воспалительные каспазы, включая каспазу-1 (человека и мышь), каспазу-4 и каспазу-5 (человека) и каспазу-11 (мышь), активируются во время формы воспалительного врожденного иммунного ПХД (III-PCD), называемого пироптозом. Активация каспазы-1 связана с образованием воспалений, которые представляют собой мультибелковые комплексы, содержащие цитозольный врожденный иммунный сенсор, молекулу-адаптер (связанный с апоптозом пятнистый белок, содержащий CARD [ASC]) и каспазу-1. Образование этого комплекса позволяет каспазе-1 подвергаться аутопротеолизу, опосредованному близостью, для высвобождения своей активной формы, которая может расщеплять целевые субстраты, включая провоспалительные цитокины интерлейкин (IL)-1β и IL-18 и порообразующую молекулу гасдермин D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Каспаза-11, каспаза-4 и каспаза-5 также могут активировать GSDMD без образования воспаления после обнаружения PAMP, таких как липополисахарид (LPS)19,20. Эти каспазы подвергаются димеризации с последующей олигомеризацией и саморасщеплением для активации при связывании с цитозольным ЛПС, что приводит к неканонической активации воспаления 24,25,26 и активации каспазы-1 присущим клетке образом, чтобы индуцировать созревание IL-1β и IL-18 20. Созревание и высвобождение этих провоспалительных цитокинов характеризуют эти каспазы как «воспалительные». Кроме того, было обнаружено, что апоптотическая каспаза-8 локализуется в воспалении, обеспечивая связь между апоптотическими и пироптотическими процессами. Исследования показали, что апоптотическая каспаза-8 также имеет решающее значение для регуляции другой формы ПМД, называемой некроптозом. Потеря каспазы-8 приводит к спонтанной активации серин-треонинкиназы 3 (RIPK3), опосредованной рецепторами, опосредованной доменной псевдокиназой смешанной линии (MLKL), чтобы управлять путем III-PCD некроптоза 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

В то время как каспазы исторически классифицировались как «апопптические» или «воспалительные» в зависимости от типа гибели клеток, которую они инициируют, растущие данные свидетельствуют о том, что существует обширное перекрестное взаимодействие между врожденными иммунными путями PCD через каспазы 3,4. Например, воспалительная каспаза-1 из инфламмасом расщепляет апоптотическую каспазу-7 в ее каноническом местеактивации 34. Активация каспазы-1 также может приводить к расщеплению апоптотических субстратов, таких как поли(АДФ-рибоза)полимераза 1 (PARP1)36. В клетках, лишенных GSDMD, каспаза-1 также может расщеплять каспазу-337,38. Кроме того, канонически апоптотическая каспаза-3 может расщеплять гасдермин Е (GSDME) для индуцирования PCD17,18, а также перерабатывать GSDMD в неактивную форму40. Кроме того, наблюдалось рекрутирование каспазы-8 в воспалительный комплекс 39,40,41,42,43,44,45, а каспаза-8 является ключевым регулятором канонической и неканонической активации воспаления 39. Существуют также перекрывающиеся и избыточные роли каспазы-8 и каспазы-1 во многих воспалительных состояниях, а врожденный иммунный PCD, характеризующийся активацией пироптотических, апоптотических и некроптотических компонентов, встречается по всему спектру заболевания 39,46,47,48,49,50.

На основе этих перекрестных помех между воспалительными и апоптотическими каспазами был выявлен ключевой пробел в механистическом понимании врожденного иммунитета и PCD, что привело к открытию PANoptosis. PANoptosis – это уникальная форма III-PCD, которая активируется в ответ на патогены, PAMP, DAMP и изменения гомеостаза и регулируется PANoptosomes – многогранными макромолекулярными комплексами, которые интегрируют компоненты из других путей гибели клеток 44,50,51,52,53,54,55 . Совокупность биологических эффектов при ПАНоптозе не может быть индивидуально объяснена только пироптозом, апоптозом или некроптозом 3,4,35,36,39,46,47,48, поскольку ПАНоптоз характеризуется активацией множественных каспаз, включая каспазу-1, каспазу-11, каспазу-8, каспазу-9, каспазу-3 и/или каспазу-7, в зависимости от контекста 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . Паноптоз все чаще участвует в инфекционных и воспалительных заболеваниях, а также в раке и терапии рака 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Учитывая существенную роль каспаз в путях гибели клеток, в том числе в апоптозе, пироптозе, некроптозе и паноптозе, важно разработать методы для характеристики их активации и понимания всей сложности путей ПХД. В протоколе подробно описан метод стимуляции клеток и измерения последующей активации каспаз (рис. 1). Этот метод использует протеолитическое расщепление каспаз, которое обычно требуется для их активации, в качестве средства их изучения. С помощью вестерн-блоттинга можно определить размеры белков, что позволяет четко визуализировать и дифференцировать неактивные прокаспазы и их активированные, расщепленные формы.

Основными преимуществами этого протокола являются: 1) его способность оценивать активацию нескольких каспаз параллельно из одной популяции эндогенных клеток для более точного определения активации ПМД и 2) использование относительно простых лабораторных методов, не требующих обширной подготовки или дорогостоящего оборудования. Предыдущие протоколы использовали вестерн-блоттинг, флуоресцентные репортеры или окрашивание антител для мониторинга активации каспазы в культуральных супернатантах, клеточных и тканевых лизатах, целых клетках с помощью микроскопии и in vivo 67,68,69,70,71, но эти методы обычно контролируют только одну или две каспазы в образце. Кроме того, в то время как синтетические пептидные субстраты, содержащие сайты расщепления каспазы, которые флуоресцируют при расщеплении, использовались для мониторинга активации каспазы в клеточных или тканевых лизатах69, эти субстраты часто могут расщепляться более чем одной каспазой, что затрудняет определение специфической активации отдельных каспаз в этой системе. Кроме того, использование вестерн-блоттинга, а не флуоресцентных репортеров или других методов, основанных на метках, позволяет исследователям использовать эндогенные клетки, а не создавать специфические клеточные линии с репортерными генами. Использование эндогенных клеток имеет множество преимуществ, в том числе тот факт, что многие иммортализированные клеточные линии испытывают дефицит ключевых молекул клеточной смерти72,73, что может повлиять на результаты. Кроме того, использование эндогенных клеток позволяет оценивать различные типы клеток, такие как макрофаги, эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки, а не одну линию. Западное блоттинг также является относительно простым и экономичным методом, который можно проводить в лабораториях по всему миру без необходимости использования большого, дорогостоящего оборудования или сложных установок.

Этот протокол широко применим в биологии для понимания как зависящих от гибели клеток, так и независимых от гибели клеток функций каспаз, включая их строительные роли и функции в других воспалительных сигнальных путях74. Применение этого метода позволяет использовать единый подход к изучению путей врожденного иммунитета PCD и воспалительной передачи сигналов при заболеваниях и состояниях, и этот протокол может быть использован для выявления критических регуляторных процессов и механистических связей, которые будут информировать о разработке будущих терапевтических стратегий.

Protocol

Использование животных и процедуры были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Детской исследовательской больницы Святого Иуды. 1. Подготовка растворов Подготовьте среду, кондиционированную L929.Планшет 1 × 106 клеток L929 (см. Т…

Representative Results

ПАНоптоз наблюдался в ответ на многочисленные бактериальные, вирусные и грибковые инфекции и другие воспалительные стимулы, а также в раковых клетках 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <sup cl…

Discussion

Мониторинг расщепления и активации каспазы дает одну из наиболее полных картин активации врожденного иммунного PCD как части врожденного иммунного ответа. Описанный здесь протокол демонстрирует стратегию мониторинга активации каспазы в ответ на инфекции IAV, HSV1 и F. novicida и стерильн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим сотрудников лаборатории Каннеганти за их комментарии и предложения, а также благодарим доктора философии Дж. Работа в нашей лаборатории поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 и CA253095 (для T.-D.K.) и американо-ливанскими сирийскими благотворительными организациями (для T.-D.K.). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathDisease MechanismsTherapeutic StrategiesCell Death ProcessesBone Marrow-derived Macrophages (BMDMs)Influenza A VirusProtein CollectionSDS-PAGECaspase Lysis Buffer
check_url/64308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image