JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

Doğuştan gelen bağışıklık, patojenlere ve steril hakaretlere yanıt olarak kritik ilk savunma hattını sağlar. Bu yanıtın önemli bir mekanik bileşeni, enfekte olmuş veya hasar görmüş hücreleri ortadan kaldırmak ve bağışıklık tepkilerini yaymak için doğuştan gelen immün programlanmış hücre ölümünün (PCD) başlatılmasıdır. Bununla birlikte, aşırı PCD inflamasyon ve patoloji ile ilişkilidir. Bu nedenle, PCD’nin aktivasyonunu ve düzenlenmesini anlamak, doğuştan gelen immün yanıtları karakterize etmenin ve hastalık spektrumunda yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinin merkezi bir yönüdür.

Bu protokol, genellikle apoptoz, pirotoz, nekroptoz ve PANoptoz dahil olmak üzere çeşitli PCD yolaklarıyla ilişkili bir sistein bağımlı proteaz ailesi olan kaspazları izleyerek doğuştan gelen immün PCD aktivasyonunu karakterize etmek için yöntemler sağlar. İlk raporlarda kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10 apoptozda başlatıcı kaspazlar ve kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7 efektör kaspazlar olarak karakterize edilirken, daha sonraki çalışmalarda inflamatuar kaspazlar, kaspaz-1, kaspaz-4, kaspaz-5 ve kaspaz-11 pirotozu tetiklemektedir. Daha önce tanımlanmış PCD yolları boyunca kaspazlar ve diğer doğuştan gelen bağışıklık ve hücre ölümü molekülleri arasında kapsamlı bir çapraz konuşma olduğu, doğuştan gelen bağışıklık ve PCD’nin mekanik anlayışında önemli bir bilgi boşluğunu tanımladığı ve PANoptozun karakterizasyonuna yol açtığı bilinmektedir. PANoptoz, diğer hücre ölüm yollarından kaspazlar da dahil olmak üzere bileşenleri entegre eden PANoptozom kompleksleri tarafından düzenlenen benzersiz bir doğuştan gelen immün inflamatuar PCD yoludur.

Burada, çeşitli uyaranlara yanıt olarak kaspazların aktivasyonunu değerlendirmek için yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, PCD yolaklarının hem in vitro hem de in vivo karakterizasyonuna izin verir, çünkü aktif kaspazlar, optimal antikorlar ve lekelenme koşulları kullanılarak batı lekelenmesi ile görselleştirilebilen proteolitik bölünmeye uğrar. Aynı hücresel popülasyondan çoklu kaspazların aktivasyonunun değerlendirilmesine izin veren ve PCD süreçlerinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlayan bir protokol ve batı lekeleme iş akışı oluşturulmuştur. Bu yöntem, sağlık ve hastalıktaki hücresel süreçler boyunca PCD yollarını değerlendirmek için gelişim, homeostaz, enfeksiyon, inflamasyon ve kanserdeki araştırma alanlarına uygulanabilir.

Introduction

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, enfeksiyon sırasında ve doku hasarı ve homeostazdaki değişiklikler gibi steril uyaranlara yanıt olarak ilk savunma hattı olarak işlev görür. Hücre yüzeyindeki ve sitoplazmadaki doğuştan gelen bağışıklık sensörleri, enflamatuar sinyal yollarını ve hücresel yanıtları tetiklemek için patojen veya hasarla ilişkili moleküler paternlere (sırasıyla PAMP’ler veya DAMP’ler) yanıt verir. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin kilit süreçlerinden biri, enfekte olmuş veya hasarlı hücreleri çıkarmak ve daha fazla doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini yönlendirmek için hücre ölümünün indüklenmesidir. Programlanmış hücre ölümü (PCD), türler arasında oldukça korunmuş bir süreçtir ve doğuştan gelen bir bağışıklık mekanizması olarak evrimsel önemini vurgulamaktadır.

Tüm hücre tiplerinde aktive edilebilen birkaç doğuştan gelen immün PCD yolu vardır. Kaspazlar, geleneksel olarak enflamatuar olmayan apoptoz yolunun yanı sıra pirotoz, nekroptoz ve PANoptosis 1,2,3,4,5 gibi enflamatuar PCD yolları da dahil olmak üzere birçok PCD yolunda kritik olan, yüksek oranda korunmuş, hücre içi, sistein bağımlı proteazların önemli bir ailesidir. . İyi tanımlanmış 11 insan ve 10 murin kaspazı ve fonksiyonel olabilen psödo-kaspazlar vardır ve çoğu aktivasyon için bölünme gerektiren inaktif monomerik veya dimerik pro-kaspazlar olarak yapısal olarak ifade edilir 6,7. Kaspazlar ayrıca multiprotein komplekslerinin işe alınması ve oluşumu için önemli alanlar içerir. Bunlar arasında kaspaz-1, kaspaz-2, kaspaz-4, kaspaz-5, kaspaz-9 ve kaspaz-11’de bulunabilen kaspaz aktivasyon ve işe alım alanı (CARD) veya kaspaz-8 ve kaspaz-10’da bulunan ölüm efektör alanı (DED) bulunur. Hem proteolitik aktiviteleri hem de multiprotein kompleksleri oluşturma yetenekleri sayesinde, kaspazlar doğuştan gelen immün PCD’nin kritik itici güçleridir.

Doğuştan gelen immün PCD’de kaspazların rolü ilk olarak apoptozda tanımlanmıştır; burada başlatıcı kaspazlar, kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10, cellat kaspazları, kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7’yi aktive ederekhücre ölümünü 8,9,10,11,12 olarak yönlendirmiştir. Başlatıcı kaspazlar çeşitli sinyal kaskadları ile aktive edilebilir; ekstrinsik yolak, hücre dışı ligandın neden olduğu ölüm reseptörü sinyallemesi yoluyla kaspaz-8’i aktive eder ve intrinsik yolak, mitokondriyal bütünlüğün bozulması yoluyla kaspaz-9’u aktive eder13. Aktif başlatıcı kaspazlar, aktif formlarını üretmek için cellat kaspazlarının büyük ve küçük katalitik alt birimlerini ayıran bağlayıcıyı ayırır. Cellat, daha sonra hücreyi parçalamak için substratlarını parçalara ayırır, bu da DNA bozulmasına, zar ağartmasına, nükleer parçalanmaya ve apoptotik cisimlerin salınmasına neden olur14,15. Bu süreç tipik olarak, ölmekte olan hücrelerin efferositoz16 ile derhal temizlenmesiyle birleştiğinde, litik olmayan ve enflamatuar olmayan bir hücre ölümü formunda sona erer. Bununla birlikte, efferositozdaki kusurlar veya fagositik hücrelerin eksikliği, apoptotik hücrelerin birikmesine neden olabilir ve bu da daha sonra litik ve enflamatuar hücre ölümüne maruz kalır17,18.

Kaspaz-1 (insan ve fare), kaspaz-4 ve kaspaz-5 (insan) ve kaspaz-11 (fare) dahil olmak üzere enflamatuar kaspazların, pirotoz adı verilen bir inflamatuar doğuştan gelen immün PCD (iii-PCD) formu sırasında aktive olduğu keşfedilmiştir. Kaspaz-1 aktivasyonu, sitozolik doğuştan gelen bir bağışıklık sensörü, bir adaptör molekülü (bir CARD [ASC] içeren apoptozla ilişkili leke benzeri protein) ve kaspaz-1 içeren multiprotein kompleksleri olan enflamatuarların oluşumu ile ilişkilidir. Bu kompleksin oluşumu, kaspaz-1’in aktif formunu serbest bırakmak için yakınlık aracılı otoproteolize maruz kalmasına izin verir, bu da pro-inflamatuar sitokinler interlökin (IL)-1β ve IL-18 ve gözenek oluşturan molekül gasdermin D (GSDMD) 19,20,21,22,23 dahil olmak üzere hedef substratları parçalayabilir. . Kaspaz-11, kaspaz-4 ve kaspaz-5, lipopolisakkarit (LPS) 19,20 gibi PAMP’leri algıladıktan sonra enflamatuarın yukarı akış oluşumu olmadan GSDMD’yi aktive edebilir. Bu kaspazlar dimerizasyona uğrar, ardından oligomerizasyon ve sitozolik LPS’ye bağlandıktan sonra aktivasyon için kendi kendine bölünmeye uğrar, bu da IL-1β ve IL-18 olgunlaşmasını indüklemek için kanonik olmayan enflamatuar aktivasyon24,25,26 ve hücreye özgü bir şekilde kaspaz-1 aktivasyonuna yol açar 20. Bu pro-inflamatuar sitokinlerin olgunlaşması ve salınması, bu kaspazları “enflamatuar” olarak karakterize eder. Ek olarak, apoptotik kaspaz-8’in enflamatuar lokalize olduğu ve apoptotik ve piroptotik süreçler arasında bir bağlantı sağladığı bulunmuştur. Çalışmalar, apoptotik kaspaz-8’in nekroptoz adı verilen başka bir PCD formunu düzenlemek için de kritik olduğunu bulmuştur. Kaspaz-8 kaybı, nekrotozun III-PCD yolunu 27,28,29,30,31,32,33,34,35 yönlendirmek için spontan reseptör ile etkileşime giren serin-treonin kinaz 3 (RIPK3) aracılı karışık soy kinaz etki alanı benzeri psödokinaz (MLKL) aktivasyonu ile sonuçlanır.

Kaspazlar tarihsel olarak başlattıkları hücre ölümünün türüne göre “apoptotik” veya “enflamatuar” olarak sınıflandırılmış olsa da, artan kanıtlar, doğuştan gelen immün PCD yolları arasında kaspazlar 3,4 yoluyla kapsamlı bir çapraz konuşma olduğunu göstermektedir. Örneğin, enflamatuarlardan gelen inflamatuar kaspaz-1, apoptotik kaspaz-7’yi kanonik aktivasyon bölgesi34’te ayırır. Kaspaz-1 aktivasyonu ayrıca poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP1) 36 gibi apoptotik substratların bölünmesine de yol açabilir. GSDMD’den yoksun hücrelerde, kaspaz-1 ayrıca kaspaz-3 37,38’i de parçalayabilir. Ek olarak, kanonik olarak apoptotik kaspaz-3, PCD17,18’i indüklemek için gasdermin E’yi (GSDME) parçalayabilir ve ayrıca GSDM’yi inaktif bir form40’a işleyebilir. Ayrıca, enflamatuar komplekse kaspaz-8 alımı 39,40,41,42,43,44,45 olarak gözlemlenmiştir ve kaspaz-8, kanonik ve kanonik olmayan enflamatuar aktivasyonun önemli bir düzenleyicisidir39. Birçok enflamatuar durumda kaspaz-8 ve kaspaz-1 için örtüşen ve gereksiz roller de vardır ve piroptotik, apoptotik ve nekroptetik bileşenlerin aktivasyonu ile karakterize doğuştan gelen immün PCD, hastalık spektrumunda 39,46,47,48,49,50 oranında ortaya çıkar.

Enflamatuar ve apoptotik kaspazlar arasındaki bu çapraz konuşmaya dayanarak, doğuştan gelen bağışıklık ve PCD’nin mekanik anlayışında önemli bir boşluk tespit edildi ve PANoptozun keşfine yol açtı. PANoptoz, patojenlere, PAMP’lara, DAMP’lere ve homeostazdaki değişikliklere yanıt olarak aktive olan ve PANoptozomlar tarafından düzenlenen benzersiz bir III-PCD şeklidir – diğer hücre ölüm yollarından bileşenleri entegre eden çok yönlü makromoleküler kompleksler 44,50,51,52,53,54,55 . PANoptozdaki biyolojik etkilerin toplamı tek başına piroptoz, apoptoz veya nekroptoz ile tek başına 3,4,35,36,39,46,47,48 ile açıklanamaz, çünkü PANoptoz, kaspaz-1, kaspaz-11, kaspaz-8, kaspaz-9, kaspaz-3 ve / veya kaspaz-7 dahil olmak üzere çoklu kaspazların aktivasyonu ile karakterize edilir. bağlama bağlı olarak 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptoz, bulaşıcı ve enflamatuar hastalıkların yanı sıra kanserler ve kanser tedavilerinde giderek daha fazla rol oynamaktadır 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Apoptoz, piroptoz, nekroptoz ve PANoptoz dahil olmak üzere hücre ölüm yolakları boyunca kaspazların temel rolü göz önüne alındığında, aktivasyonlarını karakterize etmek ve PCD yollarının tam karmaşıklığını anlamak için teknikler geliştirmek önemlidir. Buradaki protokol, hücreleri uyarmak ve kaspazların sonraki aktivasyonunu ölçmek için bir yöntemi detaylandırmaktadır (Şekil 1). Bu yöntem, genellikle aktivasyonları için gerekli olan kaspazların proteolitik bölünmesini, onları incelemek için bir araç olarak kullanır. Batı lekelenmesi yoluyla, protein boyutları belirlenebilir, bu da inaktif pro-kaspazların ve bunların aktif, parçalanmış formlarının net bir şekilde görselleştirilmesine ve farklılaştırılmasına izin verir.

Bu protokolün başlıca avantajları, 1) PCD aktivasyonunu daha doğru bir şekilde belirlemek için tek bir endojen hücre popülasyonundan paralel olarak çoklu kaspazların aktivasyonunu değerlendirme yeteneği ve 2) kapsamlı eğitim veya pahalı ekipman gerektirmeyen nispeten basit laboratuvar tekniklerinin kullanılmasıdır. Önceki protokoller, kültür süpernatantlarında, hücre ve doku lizatlarında, mikroskopi yoluyla tüm hücrelerde ve in vivo 67,68,69,70,71’de kaspaz aktivasyonunu izlemek için batı lekeleme, floresan muhabirleri veya antikor boyama yöntemini kullanmıştır, ancak bu teknikler genellikle bir numunede sadece bir veya iki kaspazı izler. Ayrıca, bölünme üzerine floresan kaspaz bölünme bölgeleri içeren sentetik peptit substratları, hücre veya doku lizatlarında kaspaz aktivasyonunu izlemek için kullanılmış olsa da, bu substratlar genellikle birden fazla kaspaz tarafından parçalanabilir ve bu da bu sistemdeki bireysel kaspazların spesifik aktivasyonunu belirlemeyi zorlaştırır. Ek olarak, floresan muhabirlerin veya diğer etiket tabanlı yöntemlerin kullanımı yerine batı lekelenmesinin kullanılması, araştırmacıların muhabir genleriyle spesifik hücre çizgileri oluşturmak yerine endojen hücreleri kullanmalarına izin verir. Endojen hücrelerin kullanılmasının, birçok ölümsüzleştirilmiş hücre çizgisinin anahtar hücre ölüm molekülleri72,73’te eksik olması da dahil olmak üzere sonuçları etkileyebilecek birçok avantajı vardır. Ek olarak, endojen hücrelerin kullanılması, tek bir soy yerine makrofajlar, epitel hücreleri ve endotel hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinin değerlendirilmesine izin verir. Batı lekelemesi aynı zamanda büyük, pahalı ekipmanlara veya karmaşık kurulumlara ihtiyaç duymadan dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlarda gerçekleştirilebilen nispeten basit ve uygun maliyetli bir tekniktir.

Bu protokol, diğer enflamatuar sinyal yolaklarındaki iskele rolleri ve işlevleri de dahil olmak üzere kaspazların hem hücre ölümüne bağımlı hem de hücre ölümünden bağımsız işlevlerini anlamak için biyoloji genelinde yaygın olarak uygulanabilir74. Bu yöntemin uygulanması, doğuştan gelen immün PCD yolaklarının ve hastalıklar ve koşullar arasında enflamatuar sinyalleşmenin incelenmesinde birleşik bir yaklaşıma izin verir ve bu protokol, gelecekteki terapötik stratejilerin gelişimini bilgilendirecek kritik düzenleyici süreçleri ve mekanik bağlantıları tanımlamak için kullanılabilir.

Protocol

Hayvan kullanımı ve prosedürleri, St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Çözümlerin hazırlanması L929 şartlandırılmış medyayı hazırlayın.Plaka 1 × 50 mL L929 kültür ortamı içeren 182cm2 doku kültürü şişesinde 106 L929 hücresi (bkz. Malzeme Tablosu) (ortamın hazırlanması için bakınız). <li…

Representative Results

PANoptoz, çok sayıda bakteriyel, viral ve fungal enfeksiyona ve diğer enflamatuar uyaranlara ve ayrıca kanser hücrelerinde 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 yanıt olarak gözlenmiştir.<sup class="…

Discussion

Kaspaz bölünmesi ve aktivasyonunun izlenmesi, doğuştan gelen immün yanıtın bir parçası olarak doğuştan gelen immün PCD aktivasyonunun en kapsamlı resimlerinden birini sağlar. Burada açıklanan protokol, IAV, HSV1 ve F. novicida…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kanneganti laboratuvarı üyelerine yorum ve önerileri için teşekkür ederiz ve bilimsel düzenleme desteği için J. Gullett, PhD’ye teşekkür ederiz. Laboratuvarımızdaki çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 ve CA253095 (T.-D.K.) ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Hayır Kurumları (T.-D.K.) tarafından desteklenmektedir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathDisease MechanismsTherapeutic StrategiesCell Death ProcessesBone Marrow-derived Macrophages (BMDMs)Influenza A VirusProtein CollectionSDS-PAGECaspase Lysis Buffer
check_url/64308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image