Coleta de espermatozoides e análise de espermatozoides assistida por computador no modelo Teleost japonês Medaka (Oryzias latipes)

Summary

Este artigo descreve dois métodos rápidos e eficientes para a coleta de espermatozoides do pequeno modelo de medaka de peixe (Oryzias latipes), bem como um protocolo para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma usando a análise de espermatozoides assistida por computador (CASA).

Abstract

A medaka japonesa (Oryzias latipes) é um peixe teleósteo e um modelo emergente de vertebrados para pesquisa em ecotoxicologia, desenvolvimento, genética e fisiologia. Medaka também é usado extensivamente para investigar a reprodução de vertebrados, que é uma função biológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A qualidade do esperma é um importante indicador da fertilidade masculina e, portanto, do sucesso da reprodução. Técnicas para extração de espermatozoides e análise de espermatozoides estão bem documentadas para muitas espécies, incluindo peixes teleósteos. A coleta de espermatozoides é relativamente simples em peixes maiores, mas pode ser mais complicada em peixes modelo pequeno, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe, o medaka japonês: dissecção dos testículos e massagem abdominal. Este artigo demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Este artigo também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para avaliar objetivamente vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, duração da motilidade, concentração relativa). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

Introduction

Medaka japonês é um pequeno peixe teleósteo de água doce que põe ovos nativo do leste da Ásia. Medaka tornou-se um excelente sistema modelo de vertebrados para estudos de ecotoxicologia, genética do desenvolvimento, genômica e biologia evolutiva e fisiologia ^1,2. Semelhante ao popular peixe-zebra, eles são relativamente fáceis de reproduzir e altamente resistentes a muitas doenças comuns de peixes ^1,2. Existem várias vantagens em usar a medaka como modelo, incluindo um curto tempo de geração, embriões transparentes ^1,2 e um genoma sequenciado³. Ao contrário do peixe-zebra, o medaka tem um gene⁴ que determina o sexo, bem como uma alta temperatura (de 4-40 °C) e tolerância à salinidade (espécie euryhalina)⁵. Além disso, muitas ferramentas genéticas e anatômicas, bem como protocolos 6,7,8,9,10,11,12^, foram desenvolvidos em Medaka para facilitar o estudo de sua biologia.

A reprodução é uma função fisiológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A reprodução de vertebrados requer uma miríade de eventos precisamente orquestrados, incluindo a produção de ovócitos nas fêmeas e a produção de espermatozoides nos machos. Os espermatozoides são células únicas, produzidas através do complexo processo de espermatogênese, no qual existem vários pontos de verificação para garantir a entrega de um produto de alta qualidade¹³. A qualidade dos gametas tornou-se um foco em estudos de aquicultura e população de peixes devido ao seu impacto no sucesso da fertilização e na sobrevivência larval. A qualidade dos espermatozoides é, portanto, um importante indicador da fertilidade masculina em vertebrados.

Três fatores úteis para avaliar a qualidade do esperma de peixes são motilidade, progressividade e longevidade. A porcentagem de motilidade e a motilidade progressiva são indicadores comuns da qualidade espermática, pois o movimento progressivo é necessário e se correlaciona fortemente com o sucesso da fertilização^14,15. A duração do movimento também é um indicador importante nos peixes, pois os espermatozoides permanecem totalmente móveis por menos de 2 minutos na maioria das espécies de teleósteos e a trajetória dos espermatozoides é geralmente menos linear do que nos mamíferos¹⁵. No entanto, muitos estudos que avaliaram a motilidade espermática no passado se basearam em métodos subjetivos ou semiquantitativos de análise espermática^15,16. Por exemplo, a motilidade espermática na medaka foi estimada no passado visualmente sob um microscópio¹⁷. Também foi estimada por meio do registro do movimento espermática e do uso de software de imagem para mesclar quadros e medir o caminho e a velocidade de natação^18,19,20. Tais abordagens muitas vezes carecem de robustez, proporcionando resultados diferentes de acordo com a pessoa que realiza a análise^15,21.

A análise de esperma assistida por computador (CASA) foi inicialmente desenvolvida para mamíferos. O CASA é um método quantitativo rápido para avaliar a qualidade dos espermatozoides por meio do registro e mensuração da velocidade e trajetória de forma automatizada¹⁵. Em peixes, tem sido utilizado em diferentes espécies para monitorar os efeitos de diversos poluentes da água sobre a qualidade dos espermatozoides, para identificar progenitores interessantes para melhorar o reprodutor, melhorar a eficiência da criopreservação e armazenamento e otimizar as condições de fertilização¹⁵. Portanto, é uma ferramenta poderosa para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma em diferentes espécies de vertebrados. No entanto, devido à importante diversidade nas estratégias reprodutivas entre os peixes, o esperma dos peixes teleósteos difere do dos mamíferos e de uma espécie de peixe para outra. Os peixes teleósteos, que fertilizam principalmente os óvulos externamente liberando gametas na água, possuem espermatozoides altamente concentrados que são relativamente simples em estrutura, sem acrossoma, ao contrário dos mamíferos, que fertilizam internamente e, portanto, não precisam compensar a diluição na água, mas têm que suportar fluidos mais viscosos¹⁴. Além disso, os espermatozoides da maioria dos peixes se movem rapidamente, mas ficam totalmente móveis por menos de 2 minutos após a ativação, embora existam várias exceções^15,22. Como a motilidade pode diminuir rapidamente na maioria dos peixes, deve-se tomar extremo cuidado com o momento da análise após a ativação ao determinar um protocolo de análise de espermatozoides para peixes.

A reprodução é um dos campos da biologia em que os teleósteos e o medaka têm sido amplamente utilizados como organismos modelo. De fato, os machos medaka apresentam comportamentos reprodutivos e sociais interessantes, como a guarda do acasalamento^23,24. Além disso, existem diversas linhagens transgênicas para estudar o controle neuroendócrino da reprodução nessa espécie^25,26,27. A amostragem de espermatozoides, um procedimento que é relativamente simples em peixes maiores, pode ser mais complicada em peixes pequenos modelos, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Por esse motivo, a maioria dos estudos envolvendo amostragem espermática em extrato de medaka milt (sêmen de peixe) por esmagamento dissecou testículos ^17,28,29,30. Alguns estudos também utilizam uma massagem abdominal modificada para expressar o milt diretamente no meio ativador^18,19,20; no entanto, com este método é difícil visualizar a quantidade e a cor do milt extraído. No peixe-zebra, a massagem abdominal é comumente utilizada para expressar o milt, que é imediatamente coletado em um tubo capilar^31,32,33. Esse método permite estimar o volume de milt, bem como a observação da cor ejaculada, que é um indicador rápido e simples da qualidade espermática^32,33. Portanto, falta um protocolo claro e bem descrito para coleta e análise de espermatozoides para o medaka.

Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe japonês medaka: dissecção de testículos e massagem abdominal com tubos capilares. Isso demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes, à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Ele também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para medir de forma confiável vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, longevidade e concentração relativa de espermatozoides). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

Protocol

Toda a experimentação e manuseio de animais foram conduzidos de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental da Universidade Norueguesa de Ciências da Vida (NMBU). Os experimentos foram realizados com medaka japonesa macho adulto (6-9 meses de idade) (cepa Hd-rR) criado no NMBU (Ås, Noruega). Os métodos também foram brevemente testados em medaka japonesa macho de 9 meses de idade (cepa CAB) criada no Instituto Nacional de Pesquisa para Agricultura, Alimentação e Meio Ambiente (INRAE, Rennes…

Representative Results

Tipo de dados obtidosA análise da motilidade espermática do software SCA Evolution fornece dados sobre motilidade (porcentagem de espermatozoides móveis e imóveis), bem como progressividade (porcentagem de espermatozoides progressivos e não progressivos) e velocidade (porcentagem de espermatozoides rápidos, médios e lentos). Também combina progressividade e velocidade (progressiva rápida, progressiva média, não progressiva). Esses rótulos são baseados em medidas (Fig…

Discussion

A osmolalidade é um fator importante na ativação do espermatozoide de peixes^36,37. Geralmente, os espermatozoides são imóveis nos testículos e tornam-se móveis em meios hiperosmóticos em relação ao líquido seminal para peixes marinhos e hipo-osmóticos em relação ao líquido seminal para peixes de água doce³⁷. Semelhante ao sangue, o plasma seminal em peixes de água doce é tipicamente menor do que o de peixes marinhos (cerc…

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040