Raccolta spermatica e analisi dello sperma assistita da computer nel modello Teleoste Medaka giapponese (Oryzias latipes)

Summary

Questo articolo descrive due metodi rapidi ed efficienti per la raccolta dello sperma dal piccolo modello di pesce medaka (Oryzias latipes), nonché un protocollo per valutare in modo affidabile la qualità dello sperma utilizzando l’analisi dello sperma assistita da computer (CASA).

Abstract

Il medaka giapponese (Oryzias latipes) è un pesce teleosteo e un modello di vertebrato emergente per la ricerca ecotossicologica, dello sviluppo, genetica e fisiologia. Medaka è anche ampiamente utilizzato per studiare la riproduzione dei vertebrati, che è una funzione biologica essenziale in quanto consente a una specie di perpetuarsi. La qualità dello sperma è un indicatore importante della fertilità maschile e, quindi, del successo riproduttivo. Le tecniche per l’estrazione dello sperma e l’analisi degli spermatozoi sono ben documentate per molte specie, compresi i pesci teleostei. La raccolta dello sperma è relativamente semplice nei pesci più grandi, ma può essere più complicata nei piccoli pesci modello in quanto producono meno spermatozoi e sono più delicati. Questo articolo, quindi, descrive due metodi di raccolta dello sperma nel piccolo pesce modello, medaka giapponese: dissezione dei testicoli e massaggio addominale. Questo documento dimostra che entrambi gli approcci sono fattibili per medaka e mostra che il massaggio addominale può essere eseguito un numero ripetuto di volte mentre il pesce si riprende rapidamente dalla procedura. Questo articolo descrive anche un protocollo per l’analisi dello sperma assistita da computer in medaka per valutare oggettivamente diversi importanti indicatori della qualità dello sperma di medaka (motilità, progressività, durata della motilità, concentrazione relativa). Queste procedure, specificate per questo utile modello di piccolo teleosteo, miglioreranno notevolmente la comprensione dei fattori ambientali, fisiologici e genetici che influenzano la fertilità nei maschi vertebrati.

Introduction

Il medaka giapponese è un piccolo pesce teleosteo d’acqua dolce originario dell’Asia orientale. Medaka è diventato un eccellente sistema modello di vertebrati per l’ecotossicologia, la genetica dello sviluppo, la genomica e gli studi di biologia evolutiva e fisiologia ^1,2. Simili al popolare zebrafish, sono relativamente facili da allevare e altamente resistenti a molte malattie comuni dei pesci ^1,2. Ci sono diversi vantaggi nell’utilizzare medaka come modello, tra cui un breve tempo di generazione, embrioni trasparenti ^1,2 e un genoma sequenziato³. A differenza del pesce zebra, il medaka ha^{un gene 4} che determina il sesso e una tolleranza alle alte temperature (da 4 a 40 °C) e alla salinità (specie eurialine)⁵. Inoltre, molti strumenti genetici e anatomici, così come i protocolli 6,7,8,9,10,11,12^, sono stati sviluppati in medaka per facilitare lo studio della sua biologia.

La riproduzione è una funzione fisiologica essenziale in quanto consente a una specie di perpetuarsi. La riproduzione dei vertebrati richiede una miriade di eventi orchestrati con precisione, tra cui la produzione di ovociti nelle femmine e la produzione di spermatozoi nei maschi. Gli spermatozoi sono cellule uniche, prodotte attraverso il complesso processo di spermatogenesi, in cui sono in atto una serie di punti di controllo per garantire la consegna di un prodotto di alta qualit๳. La qualità dei gameti è diventata un punto focale negli studi sull’acquacoltura e sulla popolazione ittica a causa del suo impatto sul successo della fecondazione e sulla sopravvivenza delle larve. La qualità dello sperma è, quindi, un indicatore importante della fertilità maschile nei vertebrati.

Tre fattori utili per valutare la qualità dello sperma di pesce sono la motilità, la progressività e la longevità. La motilità percentuale e la motilità progressiva sono indicatori comuni della qualità dello sperma poiché il movimento progressivo è necessario e correlato fortemente con il successo della fecondazione^14,15. Anche la durata del movimento è un indicatore importante nei pesci, poiché gli spermatozoi rimangono completamente mobili per meno di 2 minuti nella maggior parte delle specie di teleostei e la traiettoria degli spermatozoi è generalmente meno lineare rispetto ai mammiferi¹⁵. Tuttavia, molti studi che valutavano la motilità degli spermatozoi in passato si basavano su metodi soggettivi o semi-quantitativi di analisi degli spermatozoi^15,16. Ad esempio, la motilità degli spermatozoi nel medaka è stata stimata in passato visivamente al microscopio¹⁷. È stato anche stimato registrando il movimento degli spermatozoi e utilizzando un software di imaging per unire i fotogrammi e misurare il percorso e la velocità di nuoto^18,19,20. Tali approcci spesso mancano di robustezza, fornendo risultati diversi a seconda della persona che esegue l’analisi^15,21.

L’analisi computerizzata dello sperma (CASA) è stata inizialmente sviluppata per i mammiferi. CASA è un metodo quantitativo veloce per valutare la qualità dello sperma registrando e misurando la velocità e la traiettoria in modo automatizzato¹⁵. Nei pesci, è stato utilizzato in diverse specie per monitorare gli effetti di diversi inquinanti dell’acqua sulla qualità dello sperma, per identificare progenitori interessanti per migliorare i riproduttori, per migliorare l’efficienza della crioconservazione e dello stoccaggio e per ottimizzare le condizioni per la fecondazione¹⁵. Pertanto, è un potente strumento per valutare in modo affidabile la qualità dello sperma in diverse specie di vertebrati. Tuttavia, a causa dell’importante diversità nelle strategie riproduttive tra i pesci, lo sperma del pesce teleosteo differisce da quello dei mammiferi e da una specie ittica all’altra. I pesci teleostei, che fecondano principalmente le uova esternamente rilasciando gameti in acqua, hanno spermatozoi altamente concentrati che sono relativamente semplici nella struttura senza acrosomi, a differenza dei mammiferi, che fecondano internamente e quindi non devono compensare la diluizione in acqua, ma devono sopportare fluidi più viscosi¹⁴. Inoltre, gli spermatozoi della maggior parte dei pesci si muovono rapidamente ma sono completamente mobili per meno di 2 minuti dopo l’attivazione, anche se ci sono diverse eccezioni^15,22. Poiché la motilità può diminuire rapidamente nella maggior parte dei pesci, è necessario prestare estrema attenzione ai tempi di analisi dopo l’attivazione quando si determina un protocollo di analisi dello sperma per i pesci.

La riproduzione è uno dei campi della biologia in cui teleostei e medaka sono stati ampiamente utilizzati come organismi modello. In effetti, i maschi medaka mostrano interessanti comportamenti riproduttivi e sociali, come il compagno di guardia^23,24. Inoltre, esistono diverse linee transgeniche per studiare il controllo neuroendocrino della riproduzione in questa specie^25,26,27. Il prelievo di spermatozoi, una procedura relativamente semplice nei pesci più grandi, può essere più complicato nei piccoli pesci modello in quanto producono meno spermatozoi e sono più delicati. Per questo motivo, la maggior parte degli studi che coinvolgono il campionamento dello sperma nell’estratto di medaka milt (sperma di pesce) schiacciando i testicoli sezionati 17,28,29,30. Alcuni studi utilizzano anche un massaggio addominale modificato per esprimere la milt direttamente nel mezzo attivante^18,19,20; Tuttavia, con questo metodo è difficile visualizzare la quantità e il colore del MILT estratto. Nel pesce zebra, il massaggio addominale è comunemente usato per esprimere il miglio, che viene immediatamente raccolto in un tubo capillare^31,32,33. Questo metodo consente la stima del volume di milt, nonché l’osservazione del colore eiaculato, che è un indicatore rapido e semplice della qualità dello sperma^32,33. Pertanto, manca un protocollo chiaro e ben descritto per la raccolta e l’analisi dello sperma per medaka.

Questo articolo descrive quindi due metodi di raccolta dello sperma nel piccolo modello di pesce medaka giapponese: dissezione dei testicoli e massaggio addominale con tubi capillari. Dimostra che entrambi gli approcci sono fattibili per medaka e mostra che il massaggio addominale può essere eseguito un numero ripetuto di volte mentre il pesce si riprende rapidamente dalla procedura. Descrive anche un protocollo per l’analisi dello sperma assistita da computer in medaka per misurare in modo affidabile diversi importanti indicatori della qualità dello sperma di medaka (motilità, progressività, longevità e concentrazione relativa di spermatozoi). Queste procedure, specificate per questo utile modello di piccolo teleosteo, miglioreranno notevolmente la comprensione dei fattori ambientali, fisiologici e genetici che influenzano la fertilità nei maschi vertebrati.

Protocol

Tutte le sperimentazioni e la gestione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l’Università norvegese di scienze della vita (NMBU). Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando maschi adulti (6-9 mesi) di medaka giapponese (ceppo Hd-rR) allevati presso NMBU (Ås, Norvegia). I metodi sono stati anche brevemente testati in medaka giapponese maschio di 9 mesi (ceppo CAB) allevato presso l’Istituto nazionale di ricerca per l’agricoltura, l’alimenta…

Representative Results

Tipo di dati ottenutiL’analisi della motilità degli spermatozoi del software SCA Evolution fornisce dati sulla motilità (percentuale di spermatozoi mobili e immobili), nonché sulla progressività (percentuale di spermatozoi progressivi e non progressivi) e sulla velocità (percentuale di spermatozoi rapidi, medi e lenti). Combina anche progressività e velocità (progressivo rapido, medio progressivo, non progressivo). Queste etichette si basano su misurazioni (figura 3A) e calcoli (<strong class=…

Discussion

L’osmolalità è un fattore importante nell’attivazione dello sperma di pesce^36,37. Generalmente, gli spermatozoi sono immobili nei testicoli e diventano mobili nei mezzi iperosmotici rispetto al liquido seminale per i pesci marini e ipo-osmotici rispetto al liquido seminale per i pesci d’acqua dolce³⁷. Simile al sangue, il plasma seminale nei pesci d’acqua dolce è tipicamente inferiore a quello dei pesci marini (circa 300 mOsmol/kg rispe…

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040