Spermieuppsamling och datorstödd spermieanalys i teleostmodellen japansk medaka (Oryzias latipes)

Summary

Denna artikel beskriver två snabba och effektiva metoder för att samla spermier från den lilla modellen fisk medaka (Oryzias latipes), samt ett protokoll för tillförlitlig bedömning av spermiekvalitet med hjälp av datorstödd spermieanalys (CASA).

Abstract

Japansk medaka (Oryzias latipes) är en teleostfisk och en framväxande ryggradsdjursmodell för ekotoxikologi, utvecklings-, genetik- och fysiologiforskning. Medaka används också i stor utsträckning för att undersöka ryggradsdjurens reproduktion, vilket är en viktig biologisk funktion eftersom det gör att en art kan fortsätta. Spermiekvalitet är en viktig indikator på manlig fertilitet och därmed reproduktionsframgång. Tekniker för att extrahera spermier och spermieanalys är väl dokumenterade för många arter, inklusive teleostfisk. Att samla spermier är relativt enkelt i större fiskar men kan vara mer komplicerat i små modellfiskar eftersom de producerar mindre spermier och är mer känsliga. Denna artikel beskriver därför två metoder för spermauppsamling i den lilla modellfisken, japansk medaka: testiklardissektion och bukmassage. Detta dokument visar att båda tillvägagångssätten är möjliga för medaka och visar att bukmassage kan utföras ett upprepat antal gånger eftersom fisken snabbt återhämtar sig från proceduren. Denna artikel beskriver också ett protokoll för datorstödd spermieanalys i medaka för att objektivt bedöma flera viktiga indikatorer på medaka spermiekvalitet (rörlighet, progressivitet, varaktighet av rörlighet, relativ koncentration). Dessa procedurer, specificerade för denna användbara lilla teleostmodell, kommer att öka förståelsen för de miljömässiga, fysiologiska och genetiska faktorer som påverkar fertiliteten hos ryggradsdjur.

Introduction

Japansk medaka är en liten, äggläggande sötvattensteleostfisk som är infödd i Östasien. Medaka har blivit ett utmärkt modellsystem för ryggradsdjur för ekotoxikologi, utvecklingsgenetik, genomik och evolutionsbiologi och fysiologistudier ^1,2. I likhet med den populära zebrafisken är de relativt lätta att odla och mycket resistenta mot många vanliga fisksjukdomar ^1,2. Det finns flera fördelar med att använda medaka som modell, inklusive en kort generationstid, transparenta embryon ^1,2 och ett sekvenserat genom³. Till skillnad från zebrafisk har medaka en könsbestämmande gen 4 samt en hög temperatur (från^4-40 °C) och salthalt (euryhalinarter) tolerans⁵. Dessutom har många genetiska och anatomiska verktyg, liksom protokoll 6,7,8,9,10,11,12^, utvecklats i medaka för att underlätta studien av dess biologi.

Reproduktion är en viktig fysiologisk funktion eftersom det gör det möjligt för en art att fortsätta. Ryggradsdjurens reproduktion kräver en myriad av exakt orkestrerade händelser, inklusive produktion av oocyter hos kvinnor och produktion av spermier hos män. Spermier är unika celler, producerade genom den komplexa processen med spermatogenes, där det finns ett antal kontrollpunkter på plats för att garantera leverans av en högkvalitativ produkt¹³. Könscellskvalitet har blivit ett fokus i vattenbruks- och fiskpopulationsstudier på grund av dess inverkan på gödslingsframgång och larvöverlevnad. Spermiekvalitet är därför en viktig indikator på manlig fertilitet hos ryggradsdjur.

Tre användbara faktorer för att bedöma fiskspermakvalitet är rörlighet, progressivitet och livslängd. Procentmotilitet och progressiv rörlighet är vanliga indikatorer på spermiekvalitet eftersom progressiv rörelse är nödvändig för och korrelerar starkt med befruktningsframgång^14,15. Rörelsens varaktighet är också en viktig indikator hos fisk eftersom spermierna förblir helt rörliga i mindre än 2 minuter hos de flesta teleostarter och spermiernas bana i allmänhet är mindre linjär än hos däggdjur¹⁵. Många studier som bedömde spermiernas rörlighet förlitade sig emellertid tidigare på subjektiva eller semikvantitativa metoder för att analysera spermier^15,16. Till exempel har spermiernas rörlighet i medaka tidigare uppskattats visuellt under ett mikroskop¹⁷. Det har också uppskattats genom att registrera spermiernas rörelse och använda bildprogramvara för att slå samman ramar och mäta simväg och hastighet^18,19,20. Sådana tillvägagångssätt saknar ofta robusthet, vilket ger olika resultat beroende på den person som utför analysen^15,21.

Datorstödd spermieanalys (CASA) utvecklades ursprungligen för däggdjur. CASA är en snabb kvantitativ metod för att bedöma spermiekvaliteten genom att registrera och mäta hastighet och bana på ett automatiserat sätt¹⁵. Hos fiskar har den använts i olika arter för att övervaka effekterna av flera vattenföroreningar på spermiekvaliteten, för att identifiera intressanta förfäder för att förbättra stamstocken, för att förbättra effektiviteten i kryokonservering och lagring och för att optimera förhållandena för befruktning¹⁵. Därför är det ett kraftfullt verktyg för att på ett tillförlitligt sätt bedöma spermiekvaliteten hos olika ryggradsdjur. På grund av den viktiga mångfalden i reproduktionsstrategier mellan fiskar skiljer sig dock spermierna från teleostfisk från däggdjur och från en fiskart till en annan. Teleostfisk, som främst befruktar ägg externt genom att släppa ut könsceller i vatten, har högkoncentrerade spermier som är relativt enkla i struktur utan akrosom, till skillnad från däggdjur, som gödslar internt och därför inte behöver kompensera för utspädning i vatten, men måste tåla mer viskösa vätskor¹⁴. Dessutom rör sig spermier från de flesta fiskar snabbt men är helt rörliga i mindre än 2 minuter efter aktivering, även om det finns flera undantag^15,22. Eftersom rörligheten kan minska snabbt hos de flesta fiskar, bör extrem försiktighet iakttas med tidpunkten för analys efter aktivering vid bestämning av ett spermieanalysprotokoll för fisk.

Reproduktion är ett av de områden inom biologin där teleostar och medaka har använts i stor utsträckning som modellorganismer. Faktum är att medaka-män visar intressanta reproduktiva och sociala beteenden, till exempel kompisvakt^23,24. Dessutom finns flera transgena linjer för att studera den neuroendokrina kontrollen av reproduktion i denna art^25,26,27. Spermieprovtagning, ett förfarande som är relativt enkelt i större fiskar, kan vara mer komplicerat i små modellfiskar eftersom de producerar mindre spermier och är mer känsliga. Av denna anledning, de flesta studier som involverar spermieprovtagning i medaka extrakt milt (fisksperma) genom att krossa dissekerade testiklar 17,28,29,30. Några studier använder också en modifierad bukmassage för att uttrycka milten direkt till aktiverande medium^18,19,20; Men med denna metod är det svårt att visualisera mängden och färgen på milt extraherad. I zebrafisk används bukmassage vanligtvis för att uttrycka milt, som omedelbart samlas i ett kapillärrör^31,32,33. Denna metod möjliggör uppskattning av volymen av milt, samt observation av ejakulerad färg, vilket är en snabb och enkel indikator på spermiekvalitet^32,33. Därför saknas ett tydligt och väl beskrivet protokoll för spermauppsamling och analys för medaka.

Denna artikel beskriver därför två metoder för spermieuppsamling i den lilla modellen fisk japansk medaka: testiklar dissektion och bukmassage med kapillärrör. Det visar att båda metoderna är möjliga för medaka och visar att bukmassage kan utföras ett upprepat antal gånger eftersom fisken snabbt återhämtar sig från proceduren. Det beskriver också ett protokoll för datorstödd spermieanalys i medaka för att på ett tillförlitligt sätt mäta flera viktiga indikatorer på medaka spermiekvalitet (rörlighet, progressivitet, livslängd och relativ spermiekoncentration). Dessa procedurer, specificerade för denna användbara lilla teleostmodell, kommer att öka förståelsen för de miljömässiga, fysiologiska och genetiska faktorer som påverkar fertiliteten hos ryggradsdjur.

Protocol

Alla försök och djurhantering utfördes i enlighet med rekommendationerna om försöksdjurens välbefinnande vid Norges biovetenskapliga universitet (NMBU). Experimenten utfördes med vuxen (6-9 månader gammal) manlig japansk medaka (Hd-rR-stam) uppvuxen vid NMBU (Ås, Norge). Metoderna testades också kort i 9 månader gammal manlig japansk medaka (CAB-stam) uppvuxen vid National Research Institute for Agriculture, Food, and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrike). 1. Beredning av…

Representative Results

Typ av erhållna dataSpermiemotilitetsanalys från SCA Evolution-programvaran ger data om rörlighet (procentandel rörliga och immotila spermier), samt progressivitet (procentandel progressiva och icke-progressiva spermier) och hastighet (procentandel av snabba, medelstora och långsamma spermier). Den kombinerar också progressivitet och hastighet (snabb progressiv, medium progressiv, icke-progressiv). Dessa etiketter är baserade på mätningar (figur 3A) och beräkni…

Discussion

Osmolalitet är en viktig faktor vid aktivering av fisksperma^36,37. I allmänhet är spermier immotila i testiklarna och blir rörliga i media som är hyperosmotiska i förhållande till sädesvätska för marina fiskar och hypo-osmotiska i förhållande till sädesvätska för sötvattensfiskar³⁷. I likhet med blod är sädesplasma i sötvattensfiskar vanligtvis lägre än hos marina fiskar (cirka 300 mOsmol/kg jämfört med 400 mOsmol/kg…

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040