알레르기 성 접촉 피부염의 뮤린 모델로서의 접촉 과민증

Summary

접촉 과민증 (CHS)은 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 뮤린 실험 모델입니다. CHS는 가슴과 복부의 면도 된 피부를 페인팅하여 반응성 합텐으로 감작을 기반으로하며, 희석 된 합텐으로 후속 귀 피부 챌린지를 통해 다양한 방법으로 평가되는 붓기 반응을 일으 킵니다.

Abstract

접촉 과민증 (CHS)은 마우스에서 연구 할 수있는 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 실험 모델입니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 제시하는 것을 목표로합니다. CHS를 유도하기 위해, “0”일째에, 마우스는 아세톤-에탄올 혼합물 중의 합텐 2,4,6-트리니트로클로로벤젠(TNCB)으로 복 도장에 의해 이전에 면도된 반점에 감작시킨 반면, 음성 대조군 마우스는 비히클 단독-아세톤-에탄올 혼합물로 가짜 감작되었다. “4”일째에, 기준선 귀 두께를 CHS(챌린지)의 도출 전에 시험군 및 대조군 둘 다에서 희석된 TNCB로 양쪽 귀를 페인팅함으로써 마이크로미터로 측정하였다. 24시간 후, 귀 팽윤을 마이크로미터로 측정하였다. CHS는 염증이 있는 조직에서 팽윤을 일으키는 T 세포 매개 면역 반응의 예이며, 동일한 합텐으로 피부 챌린지 후 24시간 후에 최고조에 달한다. 귀 부종의 증가는 증강 된 귀 무게, 골수퍼옥시다제 (MPO) 활성, 귀 추출물의 전염증성 사이토카인 농도, 조직 학적 검사에서 부종 진피의 두꺼움 증가 및 귀 혈관 투과성과 관련이 있습니다. 또한 대조군 마우스와 비교했을 때 시험군의 혈청에서 TNP 특이적 IgG1 항체의 농도가 증가하였다. 추가적으로, CHS는 이전에 TNCB로 감작된 공여자로부터 수득된 CHS-이펙터 세포와 함께 성공적으로 전달될 수 있다. CHS-이펙터 세포를 순진한 수용자 마우스에 정맥내 투여하였고, 이는 후속적으로 동일한 희석된 합텐으로 도전되었다. 귀 부종은 24시간 후에 마이크로미터로 측정하였다.

Introduction

알러지성 접촉성 피부염(ACD)은 합텐(haptens)이라고 불리는 저분자량 화학물질에 노출되어 발생하는 IV형 과민반응으로 인한 선진국에서 흔히 나타나는 피부 염증성 질환이다. 인간에서 접촉 감작을 일으키는 물질에는 화장품에 존재하는 중금속 이온 (크롬, 니켈, 철, 코발트), 테레빈 유, 향료, 염료 및 방부제 (예 : 파라페닐렌디아민), 일부 약물 (예 : 네오 마이신, 벤조카인), β-락탐 항생제 (즉, 페니실린), 식물에 의해 생성 된 화학 물질 (펜타 데카카테콜, 옻 아이비에 존재하는 물질) 및 사진 산업에서 사용되는 하이드로 퀴논 ^1,2 . ACD 병인학은 산업에서만 100,000 개 이상의 화학 물질이 사용되고 매년 2,000 개의 새로운 화학 물질이 합성되므로 매우 높습니다. 현재까지 접촉 합텐 / 알레르겐 일 수있는 3,700 개 이상의 분자가 확인되었습니다³. 접촉 과민 반응 (CHS)은 마우스, 기니아 피그 및 래트에서 연구 할 수있는 ACD의 실험 모델이며 유기 용매 ^4,5,6에 용해 된 반응성 화학 합텐의 국소 피부 적용에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 연구는 다양한 테스트로 측정하고 정량화 할 수있는 마우스의 CHS 반응을 연구하는 데 도움이되는 객관적인 실험실 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.

CHS는 감작(유도) 및 이펙터(챌린지) 단계로 구성됩니다. 동물 모델에서 합텐은 먼저 신체의 단백질에 공유적으로 결합하여 신 항원을 만듭니다. 감작 단계 동안, 활성화된 각질세포는 전염증성 사이토카인-종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 인터루킨 1β(IL-1β)⁷을 생성함으로써 피부 수지상 세포(sDCs)의 이동 및 성숙을 촉진한다. 표피 랑게르한스 세포 (LCs)는 CHS 유도 및 이펙터 단계⁸ 동안 항원을 존재한다. 감작 동안 합텐에 노출된 LCs는 조절 및 이펙터 세포 둘 다의 유도를 촉진한다⁽⁹). 여러 연구로부터의 증가하는 증거는 CHS 반응이 CD4+ MHC 클래스 II 제한 Th1 세포 중 어느 하나에 의해 매개될 수 있고, 특징적인 염증 침윤물을 채용하기 위해 인터페론 γ(IFN-γ)을 국부적으로 방출할 수 있고, IFN-γ을 방출할 수 있지만 대부분 각질세포에 대한 세포독성 손상을 매개할 수 있는 CD8⁺ MHC 클래스 I-제한 Tc1 림프구, 그리고 현재 또한 인터루킨 17(IL-17)-생산 Th17 세포(¹⁰), ¹¹.

다양한 종 1^2,13,14 및 합텐을 채용하는 몇몇 상이한 CHS 모델이 개발되었다 (상이한 합텐^, 용매 및 적용 시간의 상세한 비교는 표 1에 요약된다). 자주 사용되는 실험실 종 인 마우스는 CHS를 연구 할 때 몇 가지 이점을 제공합니다. 다른 종에 비해 마우스들 사이에서 더 많은 균주, 녹아웃 (KO) 및 트랜스제닉 동물이 있으며, 이는 이들을 매우 매력적인 동물로 만든다¹⁵. 또한, CHS 모델은 많은 동물을 필요로하며, 마우스는 여기에서 더 경제적입니다. 동물 모델은 모든 측면에서 ACD를 모방하지 않으며; 특히, 그들은 인간에게 흔하지 않은 딱딱함과 절망을 보여줍니다^16,17. 만성 질환의 특징은 주로 기술된 모델이 장기간 동안 합텐의 적용을 가정하지 않기 때문에 재현하기가 어렵다. 그러나, ACD의 많은 중요한 측면들이 재현된다는 것이 여기에서 확인되었다. 또한 인간과 마찬가지로 이러한 특징은 국소 알레르기 반응과 관련이 있음이 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 설명 된 합텐, 용매 및 그 적용의 선택은 결과가 수많은 시험관 내 테스트에 의해 확인되었으며 현재 버전이 확립 될 때까지 수년 동안 실험실에서 테스트되고 수정되었다는 사실에 의해 결정되었습니다. 뮤린 모델은 ACD의 발달에 관여하는 세포 서브셋 또는 사이토카인의 분석을 허용하며 새로운 치료법의 전임상 평가에 필수적이다.

Protocol

이 기사에 제시된 모든 실험은 크라쿠프의 동물 실험에 관한 제 1 차 지역 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 설명 된 모든 절차는 특히 케타민 / 자일라진을 마취제로 사용하고, 귀의 양쪽을 사용하여 물질 / 합텐을 적용하고, 귀를 자르고, 안구 제거로 혈액을 수집하는 것과 관련하여 현지 권장 사항에 따라 수행되었습니다. BALB/c (일배체형 H-2d), CBA/J (H-2k) 및 C57BL/6 (H-2…

Representative Results

CHS 유도를 위해, 동물을 150 μL의 5% TNCB 또는 비히클 단독의 가짜 감작으로 피부 페인팅(복부)을 통해 감작시켰다. “4”일째에, 양쪽 귀의 귀 부종 반응은 이전에 TNCB로 감작된 마우스(시험 그룹) 및 대조군 마우스(가짜 감작)에서 0.4% TNCB의 10 μL와 접촉페인팅(challenge)에 의해 유도되었다. 제시된 데이터는 TNCB로 감작되고 도전 4일 후에 샴페인팅된 마우스가 유사하게 도전된 샴-감작된 것들과 비?…

Discussion

CHS는 합텐을 통해 유도되며, 이는 피부의 자체 단백질 항원에 결합하여 신 항원을 생성합니다. CHS는 순환 항원 특이적 CHS-이펙터 T 세포의 국소 혈관외 모집에 의해 매개되며, 이는 도전된 조직에서 팽윤을 초래하고, 동일한 합텐⁶에 이차 피부의 노출 후 24 h를 피크로 한다. 조직의 팽윤은 주로 백혈구 및 백혈구 의존성 피브린 침착⁽²⁴)의 침윤에 의해 야기?…

Materials

70% ethanol	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	65350-M	for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655101	for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	179124
Aluminum foil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z185140
Analytical balance	Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany	PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor	MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India	MTP-E-212	automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)	Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA	BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	553441
BSA (bovine serum albumine)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	A9418	protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm	BIOLOGIX, China	15-1070	suitable for 50 mL tubes
Coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-1583	24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	14190144	no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	6522	mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers – straight	Animalab, Poznan, Poland	11251-10FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers – bent	Animalab, Poznan, Poland	11272-50FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,086	polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,094	polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.07017
Ethanol 96%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.59010
Evans blue	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	E2129
FBS (fetal bovine serum)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT501128
Formamide 99.5% (GC)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F7503
Freezer -20 °C	Bosch, Germany	GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C	Bosch, Germany	KGV36V10	mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449	Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism	GraphPad Software Inc.	v. 9.4.0
Grey soap	Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland	Bialy jelen soap bar	grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.60313
Harris hematoxylin solution	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HHS16
Hemocytometer	VWR, Avantor, U.S.A	612-5719	manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H5882
Homogenizer	QIAGEN Hilden, Germany	Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234	homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA	SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H1009
Incubator Heracell 150i	Thermo Electron LED Gmbh, Germany	41071068	37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection	Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland	cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.05108
Laboratory Centrifuge	Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany	B00013899	speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge	Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany	75002425	speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	111-0917	for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice	Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland	CBA/J, C57BL/6
Micrometer	Mitutoyo, Tokyo, Japan	193-111	digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655061	with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives	Leica Microsystems CMS GmbH, Germany	DM1000, 294011-082007	histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S9390
Olive-oil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	75343	pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555138
Ortho-dianisine dihydrochloride	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	D3252
Paraffin wax	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	76242	beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	20012027	pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter	Elmetron, Poland	CP-401
Pipettes, variable volume with tips	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	EP3123000900-1EA	3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	PERS94-0462	scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome	MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK	HIS-202A
Scissors – straight, sharp / sharp	Animalab, Poznan, Poland	14060-10FST	Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27056	black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer	BioTek Instruments, U.S.A	201446	universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S6141	e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm	Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA	33-36
Surgical scissors	Animalab, Poznan, Poland	52138-46	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z672122	tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)	Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan	C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)	Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA	T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	78510
Tubes 15 mL sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430055 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430290 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tween 20	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27173	for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath	AJL Electronic, Poland	LW102
Wax (paraffin) dispenser	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection	Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland	cat.# not avaliable
Xylene (histological grade)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	534056