Method Article

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

DOI:

10.3791/64340

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

막 곡률은 세포 이동, 세포 분열 및 소포 트래피킹과 같은 세포의 다양한 필수 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 활동에 의해 수동적으로 생성 될뿐만 아니라 단백질 상호 작용을 적극적으로 조절하고 많은 세포 내 신호 전달에 관여합니다. 따라서 단백질과 지질의 분포와 역학을 조절하는 막 곡률의 역할을 조사하는 것은 큰 가치가 있습니다. 최근에는 시험 관 내에서 곡선 막과 단백질 사이의 관계를 연구하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 기존 기술과 비교하여 새로 개발된 나노바 지지 지질 이중층(SLB)은 사전 정의된 막 곡률 및 국소 평면 제어를 통해 패턴화된 나노바 어레이에 연속 지질 이중층을 형성하여 막 곡률 생성에서 높은 처리량과 더 나은 정확도를 모두 제공합니다. 곡면막에 대한 지질 유동성과 단백질 민감도는 형광 현미경 이미징을 사용하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다. 여기에서는 나노바 어레이를 포함하는 제작된 유리 표면에 SLB를 형성하는 방법과 이러한 SLB 상의 곡률 민감성 단백질의 특성 분석에 대한 자세한 절차를 소개합니다. 또한 나노 칩 재사용 및 이미지 처리를위한 프로토콜을 다룹니다. nanobar-SLB 외에도 이 프로토콜은 곡률 감지 연구를 위한 모든 유형의 나노 구조 유리 칩에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

막 곡률은 형태 형성, 세포 분열 및 세포 이동과 같은 다양한 세포 과정에서 발생하는 세포의 중요한 물리적 매개 변수입니다1. 막 곡률이 세포 사건의 단순한 결과를 넘어선다는 것이 이제 널리 인식되고 있습니다. 대신, 단백질 상호 작용 및 세포 내 신호 전달의 효과적인 조절자로 부상했습니다. 예를 들어, 클라 트린 매개 세포 내 이입에 관여하는 여러 단백질이 곡선 막에 우선적으로 결합하여 세포 내 이입2에 대한 핫스팟을 형성하는 것으로 나타났습니다. 세포골격력에 의한 막 당김, 크기가 다른 머리 그룹을 가진 지질 비대칭의 존재, 원뿔 모양의 막 횡단 단백질의 존재, BAR 도메인 단백질(Bin, amphiphysin 및 Rvs 단백질의 이름을 따서 명명됨)과 같은 막 형성 단백질의 축적, 양친매성 나선 도메인을 막1에 삽입하는 것과 같은 막 변형의 다양한 원인이 있습니다. . 흥미롭게도 이러한 단백질과 지질은 막을 변형시킬 뿐만 아니라 막 곡률을 감지하고 우선적인 축적을 나타낼 수있습니다1. 따라서 곡률이 다른 막이 단백질과 지질의 분포와 역학을 변화시키고 관련 세포 내 과정에 대한 잠재적 영향을 변화시키는지 여부와 방법을....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 나노 칩 청소

  1. 나노칩을 패턴화된 면이 위를 향하도록 10mL 비커에 넣습니다.
    참고 :이 석영 나노 칩은 앞서 설명한 바와 같이 전자빔 리소그래피를 통해 제조되었습니다21. 칩상의 나노 구조의 기하학적 구조와 배열은 맞춤 설계 될 수있다. 여기에 사용 된 그래디언트 나노 바의 크기는 길이 2000nm, 높이 600nm, 너비 100-1000nm (100nm 스텝 세트)입니다.
  2. 비커에 98% 황산 1mL를 조심스럽게 넣고 산이 칩의 앞면과 뒷면을 완전히 덮는지 확인합니다.
    알림: 98% 황산은 부식성이 매우 높으며 피부나 눈에 닿으면 빠른 조직 파괴와 심각한 화학적 화상을 유발할 수 있습니다. 적절한 보호 기능을 갖춘 흄 후드에서 사용하십시오.
  3. 비커를 천천히 돌리고 전체 비커가 뜨거워질 때까지 200μL의 30% 과산화수소를 한 방울씩 추가합니다. 황산과 과산화수소가 잘 혼합되어 나노칩(17)으로부터 유기 분자를 제거하기 위한 피라냐 용액을 형성하는지 확인한다. 앞서 설명된 바와 같이 UV 광 및 오존 노출과 같은 깨끗한 친수성 표면 상에 SLB를 생성하기 위한 대안적인 기술이 있다(

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

나노바 설계는 포지티브 곡률 감지 단백질을 프로빙하는 데 권장되며, 각 끝에는 나노바 너비로 정의된 곡률이 있는 반원이 있고 중앙에 국부적으로 하나의 평면/제로 곡률 제어가 포함됩니다(그림 2A,B). 나노바에 SLB를 성공적으로 형성하면 그림 2C와 같이 전체 나노바 표면에 걸쳐 지질 마커 신호가 고르게 분포됩니다. 개별 나노바 이미지(그림 2D)를 평균화하여 여러 나노바의 신호를 결합할 수 있으므로 서로 다른 나노바 간의 무작위 변동을 최소화할 수 있습니다. 이전의 전자 현미경 연구는 세포 원형질막이 전체 나노구조물 주위에 컨포멀 코팅을 형성한다는 것을 보여주었다(24). 따라서, 합성 지질 이중층은 나노구조물 표면에도 단단히 부착되는 것으로 여겨지며, 이는

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 나노바-SLB 시스템은 기존의 여러 시험관 분석에서 장점의 고유한 조합을 제공합니다. 리포솜 부유 또는 침강 분석과 같이 고도로 구부러진 막에 대한 단백질의 우선적 결합을 효율적으로 나타내지만 훨씬 적은 수의 샘플이 필요하며 개별 나노바 8,29에서 보다 정확하게 정의된 곡률을 제공합니다. 또한 SLiC 분석법과 동시 비교를 위해 정밀하게 제어된 광범위한 곡률을 제공하며, SLB가 이동성이 있고 모든 크기의 나노바를 지속적으로 커버하기 때문에 다양한 곡률의 지질 조성 변화와 빛의 회절 한계 미만의 크기로 감지할 수 없는 형태학적 또는 곡률 변화에 대한 우려가 적습니다.30 . Nanobar-SLB는 또한 테더 당김 분석법으로 곡면에서 단백질의 동적 거동을 관찰할 수 있지만 튜브 생성의 처리량과 광학 트래핑 조작 경험에 의해 제한되지 않습니다

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는이 작업에 대해 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

나노 구조 제조 및 SEM 이미징을 지원하는 난양 기술 대학교 (NTU)의 난양 나노 제조 센터 (N2FC)와 파괴 광자 기술 센터 (CDPT), 단백질 정제를위한 생명 과학 학교 NTU의 단백질 생산 플랫폼 (PPP), 컨포칼 현미경을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU에 감사드립니다. 이 연구는 싱가포르 교육부(MOE)(W. Zhao, RG112/20, RG95/21 및 MOE-T2EP30220-0009), 디지털 분자 분석 및 과학 연구소(IDMxS)가 자금을 지원합니다. 우수 연구 센터 제도(W. Zhao), 휴먼 프론티어 과학 프로그램 재단(W. Zhao, RGY0088/2021), NTU 스타트업 보조금(W. Zhao), 연구 장학금을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU (X. Miao), 연구 장학금을위한 중국 장학금위원회 (J. Wu).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
무수 에탄올시그마-알드리치100983
알루미늄 호일다이아몬드RN0879999FU
앰버 바이알시그마-알드리치27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, porcine) (sodium salt)Avanti Polar Lipids, Inc.
10 mL 비커Schott-DuranSCOT211060804
50 mL 비커Schott-DuranSCOT211061706
1000 mL 비커Schott-DuranSCOT211065408두 번째 용기 
클로로포름시그마-알드리치V800117
면봉왓슨스
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세틱산)숙시닐](니켈염)Avanti Polar Lipids, Inc.
달걀 PC: L-&알파;-포스파티딜콜린(달걀, 닭고기)Avanti Polar Lipids, Inc.
F-BAR단백질 생산 Plaftorm, 생물 과학부, 난양 기술 대학교, 싱가포르단백질 및 펩타이
F-BAR+IDR단백질 생산 Plaftorm, 생물 과학부, 난양 기술 대학교, 싱가포르단백질 및 펩타이드
GFP단백질 생산 Plaftorm, 생명 과학부, 난양 기술 대학교, 싱가포르단백질 및 펩타이드
GFP-His단백질 생산 Plaftorm, 생물 과학 대학, 난양 기술 대학교, 싱가포르단백질 및 펩타이드
GraphPad PrismGraphPadV9.0.0
과산화수소, 30%(ACS 인증)Thermo Scientific
IDR
ImageJNational Institutes of Health1.50d
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Zeiss 100x(N.A.1.4) 오일 대물렌즈가 장착된 LSM 800
메탄올피셔 과학10010240
미니 엑스투더 아반티 폴라 지질(Avanti Polar Lipids, Inc.)610000-1EA
1.5 mL 마이크로튜브Greiner616201
MATLABMathworksR2018b
핵포어 친수성 멤브레인,0.1 μ mWhatman800309
인산염 완충 식염수(PBS)Life Technologies Holdings Pte Ltd.70013
폴리디메틸실록산(PDMS) 베이스다우코닝 코퍼레이션SYLGARD 184
폴리메틸실록산(PDMS) 크로스링커다우코닝 코닉SYLGARD 184
플라즈마 클리너HARRICK PLASMAPDC-002-HP
석영 나노칩동하이 카운티 알파 석영 제품 CO., LTD
수산화나트륨 시그마-알드리치795429
황산시그마-알드리치258105
텍사스 레드 DHPE: 텍사스 레드 1,2-디헥사데칸노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 SaltLife Technologies Holdings Pte Ltd.
핀셋GooiPDC-002-HP
초음파 세척기ElmaD-78224
VoterxScientific IndustriesG560E
진공 탈착기NUCERITE5312
수조JulaboTW8
840032790404840051드 인간 FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.의 H325-500 Airyscan .T1395MP

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