Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

טיפול בסוגיות מעשיות במיקרו-הזחה מבוססת מיקרוסקופיה של כוח אטומי על צמחי סחוס מפרקיים אנושיים

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

אנו מציגים גישה שלב אחר שלב לזיהוי וטיפול בבעיות הנפוצות ביותר הקשורות למיקרו-כניסות במיקרוסקופ כוח אטומי. אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות על צמחי סחוס מפרקי אנושיים מקומיים המאופיינים בדרגות שונות של ניוון המונע על ידי אוסטאוארתריטיס.

Abstract

ללא ספק, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא כיום אחת הטכניקות החזקות והשימושיות ביותר להערכת מיקרו ואפילו ננו-רמזים בתחום הביולוגי. עם זאת, כמו בכל גישה מיקרוסקופית אחרת, אתגרים מתודולוגיים יכולים להתעורר. בפרט, המאפיינים של המדגם, הכנת הדגימה, סוג המכשיר, ואת הבדיקה הזחה יכול להוביל ממצאים לא רצויים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות הללו על צמחי סחוס מפרקי בריאים כמו גם ניווניים. לשם כך, אנו מראים תחילה באמצעות גישה שלב אחר שלב כיצד ליצור, לדרג ולסווג באופן חזותי דיסקיות סחוס מפרקי ex vivo לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות הדמיה פלואורסצנטית דו-ממדית גדולה של פסיפס שלם של כל צמחי הרקמה. החוזק העיקרי של מודל ex vivo הוא בכך שהוא מורכב מסחוס אנושי זקן, ילידי, המאפשר לחקור שינויים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית מהתחלה מוקדמת ועד להתקדמות. בנוסף, מוצגים גם מלכודות נפוצות בהכנת רקמות, כמו גם הליך AFM בפועל יחד עם ניתוח הנתונים הבאים. אנו מראים כיצד שלבים בסיסיים אך חיוניים כגון הכנה ועיבוד דגימה, מאפייני דגימה טופוגרפיים הנגרמים על ידי ניוון מתקדם ואינטראקציה בין קצה הדגימה יכולים להשפיע על רכישת נתונים. אנו גם נתונים לבדיקה של הבעיות הנפוצות ביותר ב- AFM ומתארים, במידת האפשר, כיצד להתגבר עליהן. ידיעת מגבלות אלה היא בעלת חשיבות עליונה לאיסוף נכון של נתונים, פרשנותם, ובסופו של דבר, להטמעת הממצאים בהקשר מדעי רחב.

Introduction

בשל גודלם ההולך ומצטמצם של מכשירים ומערכות אלקטרוניים, ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה וציוד מבוססי מיקרו וננו צברה תאוצה. מכשיר אחד כזה הוא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שיכול לסרוק משטחים ביולוגיים ולאחזר מידע טופוגרפי או ביומכני בקנה מידה ננומטרי ומיקרומטרי 1,2. בין התכונות העצומות שלה, כלי זה יכול להיות מופעל כמו מיקרו, כמו גם nano-indenter כדי לקבל מידע על התכונות המכניות של מערכות ביולוגיות שונות 3,4,5,6. הנתונים נאספים על ידי מגע פיזי עם פני השטח באמצעות בדיקה מכנית, אשר יכול להיות קטן כמו 1 ננומטר בקצה שלה7. העיוות שנוצר של הדגימה מוצג לאחר מכן בהתבסס על עומק הכניסה של קצה הקנטיל והכוח המופעל על הדגימה8.

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה כרונית ניוונית ארוכת טווח המאופיינת בהידרדרות הסחוס המפרקי במפרקים וברקמות הסובבות, מה שעלול להוביל לחשיפה מלאה של משטחי העצם. הנטל של OA הוא משמעותי; כיום, מחצית מכלל הנשים ושליש מכלל הגברים בגילאי 65 ומעלה סובלים מ-OA9. טראומות, השמנת יתר והביומכניקה המשתנה של המפרק10 כתוצאה מכך קובעים את ניוון הסחוס המפרקי, אשר נתפס כתוצאה סופית שכיחה. המחקר החלוצי של גנץ ועמיתיו הניח כי השלבים המוקדמים של תהליך OA עשויים לכלול את התכונות הביומכניות של סחוס11, ומאז אישרו החוקרים השערה זו12. כמו כן, מקובל כי התכונות הביומכניות של הרקמה מתוזמרות באופן פונקציונלי על ידי הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, כמו גם קרוס-טוק תא-תא ומטריצת תא. כל שינוי יכול להשפיע באופן דרמטי על התפקוד הביומכני הכולל של הרקמה13. נכון להיום, אבחון OA הוא קליני ומבוסס על רדיוגרפיה רגילה14. גישה זו היא דו-צדדית: ראשית, היעדר סף חתך ניווני מוגדר לגיבוש האבחנה של OA מקשה על כימות, ושנית, שיטות הדמיה חסרות רגישות ותקינה ואינן יכולות לזהות נזק סחוס מקומי15,16,17. לשם כך, להערכת התכונות המכניות של הסחוס יש יתרון מכריע בכך שהיא מתארת פרמטר המשתנה במהלך OA ללא קשר לאטיולוגיה של המחלה ויש לו השפעה ישירה על תפקוד הרקמה בשלב מוקדם מאוד. מכשירי הזחה מודדים את הכוח שבו הרקמה מתנגדת להזחה. זהו, למעשה, לא מושג חדש; המחקרים המוקדמים ביותר מתוארכים לשנות ה-80 וה-90. בתקופה זו, מחקרים רבים הציעו כי מכשירי הזחה המיועדים למדידות ארתרוסקופיות של סחוס מפרקי יכולים להתאים היטב לזיהוי שינויים ניווניים בסחוס. אפילו לפני 30 שנה, כמה מחקרים הצליחו להוכיח כי מכשירי הזחה היו מסוגלים לזהות שינויים in vivo פני השטח של הסחוס במהלך ניוון רקמות על ידי ביצוע מדידות קשיחות דחיסה במהלך ארתרוסקופיה18,19,20.

כניסת AFM (AFM-IT) של הסחוס המפרקי מספקת מידע על תכונה מכנית מרכזית של הרקמה, כלומר נוקשות. זהו פרמטר מכני המתאר את הקשר בין עומס מוחל, לא הרסני לבין העיוות שנוצר כתוצאה מכך של אזור הרקמה המושקעת21. AFM-IT הוכח כמסוגל לכמת שינויים תלויי גיל בנוקשות ברשתות קולגן מקרוסקופיות שאינן מושפעות, ובכך להבדיל בין השינויים הפתולוגיים הקשורים להופעת OA (דרגה 0 בסולם Outerbridge בסחוס מפרקי)22. הראינו בעבר כי AFM-ITs, על בסיס ארגון כונדרוציטים מרחביים כסמן ביולוגי מבוסס תמונה לניוון סחוס מוקדם, מאפשרים לא רק לכמת אלא גם לאתר בפועל את השינויים המכניים הניווניים המוקדמים ביותר. ממצאים אלה כבר אושרו על ידי אחרים23,24. לפיכך, AFM-IT פועל ככלי מעניין לאבחון וזיהוי שינויים ניווניים מוקדמים. שינויים אלה ניתנים למדידה כבר ברמה התאית, ומעצבים מחדש את ההבנה של התהליך הפתופיזיולוגי OA.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הליך דירוג היסטולוגי וביומכני מלא של צמחי סחוס מפרקיים, החל מהכנת צמחי סחוס מקומיים ועד לרכישה ועיבוד של נתוני AFM. באמצעות גישה שלב אחר שלב, אנו מראים כיצד ליצור, לדרג ולסווג חזותית רקמת סחוס מפרקי לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות דימות פסיפס גדול דו-ממדי, ואחריו כניסות מיקרו-AFM.

למרות שכיום, AFM-IT הוא אחד הכלים הרגישים ביותר למדידת שינויים ביומכניים בסחוס7, כמו כל טכניקה אינסטרומנטלית אחרת, יש לו מגבלות ומוזרויות מעשיות25 שיכולות להוביל לרכישת נתונים שגויה. לשם כך, אנו בוחנים את הבעיות הנפוצות ביותר המתעוררות במהלך מדידות AFM של צמחי הסחוס ומתארים, במידת האפשר, כיצד למזער או להתגבר עליהן. אלה כוללים היבטים טופוגרפיים של הדגימות והקשיים לייצב אותן בסביבה תואמת AFM, מוזרויות פיזיות של פני הרקמה, והקשיים הנובעים מכך בביצוע מדידות AFM על משטחים כאלה. מוצגות גם דוגמאות לעקומות כוח מרחק שגויות, המדגישות את התנאים שעלולים לגרום להן. כמו כן נדונות מגבלות נוספות הטבועות בגיאומטריה של קצה הקנטיליבר ובשימוש במודל הרץ לניתוח הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נעשה שימוש בקונדילים של עצם הירך שנאספו מחולים שעברו ניתוח ארתרופלסטי כולל של הברך בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן, גרמניה. במחקר זה נכללו רק דגימות סחוס מפרקי מחולים עם פתולוגיות מפרקים ניווניות ופוסט-טראומטיות. אישור ועדת האתיקה המחלקתית, המוסדית והמקומית התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מס' 674/2016BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות.

הערה: תרשים זרימה של שלבי הניסוי בסדר הכרונולוגי שלהם מוצג באיור 1.

1. עיבוד רקמות ויצירת דיסקי סחוס

  1. הכנת רקמות
    1. לאחר כריתה לאחר הניתוח, הניחו את דגימות הסחוס במיכל מלא בתווך הנשר של דולבקו (DMEM) בתוספת 5% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין. ודא שהדגימות שקועות לחלוטין בתווך. משך הזמן בין כריתה כירורגית לעיבוד נוסף של הסחוס לא יעלה על 24 שעות. ודא שלאורך כל העיבוד, הדגימות שקועות במלואן במדיה כדי למנוע התייבשות דגימה.
    2. חותכים את הסחוס מהעצם באמצעות אזמל.
  2. יצירת דיסק סחוס
    1. יצירת דיסקי סחוס בקוטר 4 מ"מ באמצעות ניקוב ביופסיה.
      הערה: חשוב לבחור ולכרות את אזורי הקונדיל שבהם עובי שכבת הסחוס עולה על 1 מ"מ. זה עלול להיות בעייתי, במיוחד סביב אזורי נשיאת עומס, שבהם שכבת הסחוס בדרך כלל מאבדת את עוביה עקב תהליכי בלאי או התנוונות.
    2. הניחו את דיסקיות הסחוס בקוטר 4 מ"מ שנוצרו קודם לכן על מכשיר חיתוך בהתאמה אישית וקיבעו והחזיקו את דיסקיות הסחוס יציבות באמצעות מרית. בעת הנחת דיסקיות הסחוס על מכשיר החיתוך, יש להקפיד על כך. מקמו את הדגימות כך שהשכבה העליונה של הסחוס (האזור השטחי של הסחוס המפרקי) לא תפנה אל הלהב
    3. חותכים את דיסקיות הסחוס עם סכין גילוח. דגימות סחוס בצורת דיסק של 4 מ"מ x 1 מ"מ נוצרות, אם כן. כדי למנוע התייבשות דגימה, בצע חיתוך רקמות במהירות האפשרית.
    4. אסוף כל דיסק בעזרת מרית ומקם את דיסקי הסחוס שנוצרו לתוך צינורות 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל DMEM בתוספת 5% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין. מניחים כ-15 דיסקים בצינור אחד.
  3. חתך קריוטום של דיסקי הסחוס (לפרוסות מאונכות)
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי, וניתן להשתמש בו אם יש צורך בהדמיה צדדית של התפלגות התבנית התאית בתוך דיסקי הסחוס. זה יכול לשמש כשיטת אימות כמו התפלגות של דפוס סלולרי הוא תכונה 3D של סחוס מפרקי26. ניתן להשתמש גם בחתך אופטי ושחזורים תלת ממדיים של כל דיסקיות הסחוס באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ובכך להסיר את הצורך לחתוך את הדגימות כמתואר בפרוטוקול.
    1. מכסים את דיסק הסחוס בתווך הטבעה מסיס במים ומניחים אותו על קצהו על ידית ההקפאה (כאשר פני השטח של הדיסק מאונכים לפני השטח של הידית). במכשיר ההקפאה, מדיום ההטבעה קופא בטמפרטורות נמוכות.
    2. באמצעות קריוטום סטנדרטי, חתכו את הרקמה הצידה בעובי של 60 מיקרומטר עד שמגיעים לאמצע הדיסק (כלומר, כאשר הקריוסקציות מגיעות לאורך של 4 מ"מ) ואספו את הפרוסות. על ידי חתך הדיסק בניצב ניתן לדמיין את כל אזורי הסחוס (שטחי, אמצעי ועמוק).
    3. אספו את המקטעים על מגלשת זכוכית והסירו את אמצעי ההטבעה המסיס במים על ידי שטיפה שלוש פעמים במי מלח חוצצי פוספט (PBS).

2. מיון דיסק סחוס כפונקציה של התבנית המרחבית התאית

  1. צביעת דגימות הסחוס בצורת דיסק
    1. מניחים דיסק סחוס אחד (סעיף 1.2) בכל באר של צלחת בת 96 בארות ומוסיפים 130 מיקרוליטר של צבע פלואורסצנטי חדיר לתאים בדילול של 1:1,000 לכל באר.
    2. בדקו ויזואלית את הצלחת כולה וודאו שבכל באר מונח דיסק אחד בלבד. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור תרבית התאים הסטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. צביעת פרוסות סחוס 60 מיקרומטר
    1. מניחים בעדינות את קטעי דיסק הסחוס (סעיף 1.3) על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בעזרת מלקחיים.
    2. כסו את חלקי הסחוס באמצעי הרכבה המכיל צביעה נגדית גרעינית מסוג DAPI והניחו בעדינות כיסויים המתאימים למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    3. אטמו את הקצוות של כל כיסוי בלק שקוף רגיל והניחו לו להתייבש במשך 3 דקות.
  3. מיון והדמיה של סחוס מלמעלה למטה ומהצד
    הערה: יש לבדוק כל דיסק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מטרת שלב זה היא למיין את הדיסקים על פי התבנית התאית השלטת בהם (מחרוזות בודדות, מחרוזות כפולות, אשכולות קטנים, אשכולות גדולים או מפוזרים).
    1. הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות על מחזיק הצלחת במיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
    2. בחר את מסנן הפלואורסצנטיות המתאים של Em 495 nm/Ex 515 nm (להדמיה מלמעלה למטה של דיסקי הסחוס שהוכנו בסעיף 2.1.) או Em 358 nm/Ex 461 nm (להדמיית צד של מקטעי הסחוס שהוכנו בסעיף 2.2) ואת המטרה 10x.
      הערה: השימוש במטרה 10x מאפשר לבדוק את כל היקף הדיסק, וניתן לשלול דגימות עם צביעה לא הומוגנית או לא נכונה. עם זאת, שימוש רק במבט מלמעלה למטה עשוי לגרום לתפיסה של שינויים בארגון התא כתוצאה מניתוח שכבות הרקמה העמוקות יותר הנראות לתצפית מלמעלה למטה על ידי שחיקה שטחית. לדוגמה, מחרוזת עולה בעקבות ארקדות הקולגן יכולה להיתפס כתא בודד או תאים מפוזרים (תבנית מפוזרת)26. כתוצאה מכך, יש לבדוק את שני צידי הדיסקים כדי להבטיח בחירה נכונה של תבניות סלולריות.
    3. קבע חזותית את התבנית התאית המוצגת בכל דיסק סחוס. אין זה סביר כי דיסק יהיה רק סוג אחד של דפוס סלולרי. עבור החלק של הדיסק שבו סידור הכונדרוציטים אינו תואם את תבנית העניין, קבל את הדגימות רק אם התבנית הבלתי רצויה נמצאת ממש בפריפריה, שם מדידות AFM אינן מתבצעות (כלומר, עד 0.5 מ"מ מגבול הדיסק), וודא שזה לא יעלה על 10% מכלל פני השטח של הדיסק27, 28.
  4. רכישת תמונה של כל דיסקי הסחוס
    1. בחר את המטרה 10x של המיקרוסקופ ומקם אותו מתחת לבאר שנבחרה מראש המכילה דיסק סחוס בודד. התמקדו בדיסק כדי לראות את התבנית התאית.
    2. בחר את פונקציית הנווט כדי לקבל סקירה כללית של הבאר כולה. השתמש בלחצן העכבר השמאלי וגרור כדי לנווט למיקום במה אחר. באמצעות גלגל העכבר, הגדל והקטן את התצוגה.
      הערה: בשלב זה, תצוגה מקדימה של הבאר עם המדגם כולו ניתן לראות על ידי לחיצה כפולה על כל אזור עניין ברצף.
    3. בחר ריבוע המקיף את אזור העניין לסריקה; בשלב זה, כל האריחים הבודדים המרכיבים את הפסיפס יהיו גלויים.
    4. התאם את עוצמת החשיפה/האור כך שניתן יהיה להמחיש בבירור את התאים מהרקע. בשלב זה, הבהירות/ניגודיות של התמונה הותאמה עבור כל האריחים ולא ניתן עוד להתאים אותה בנפרד עבור כל אריח.
      הערה: מכיוון שהתאים הסמוכים לקצה הדיסק פולטים לעתים קרובות אות פלואורסצנטי גבוה יותר מאשר התאים שבמרכז, יש להתאים את הגדרות החשיפה/עוצמת האור.
      1. כדי להעריך אם זמן החשיפה מתאים לערוץ מסוים, בדוק את התפלגות האות בהיסטוגרמה. על ידי שימוש במנגנון החשיפה האוטומטי הכלול בתוכנת התמונה של המיקרוסקופ, דמיינו את כל התאים השוכנים בתוך הדיסק.
    5. בחר באפשרות נקודת מפת מיקוד של התוכנה ולאחר מכן בחר כל אריח בנפרד על-ידי לחיצה שמאלית במרכזו.
    6. בחר באפשרות מפת מיקוד. מוצג חלון עם כל האריחים שנבחרו קודם לכן. לחץ פעמיים על אריח ברשימה כדי להציג אותו ולמקד אותו כראוי.
    7. לחץ על הגדר Z כדי לשמור את תוכנית המוקד ולהמשיך לאריח הבא. לאחר התאמת תוכנית המוקד עבור כל אריח בודד, התחל ברכישת תמונה על-ידי הקשה על התחל סריקה.
      1. אם הסריקה מציגה פסים אופקיים ו/או אנכיים כהים יותר, ייתכן שהסיבה לכך היא תאורה לא נכונה ולא אחידה של המסגרות הבודדות. פתור זאת באמצעות האפשרות הצללה מקושרת המשולבת בתוכנה לפני הסריקה בפועל.
    8. שמור, ייצא והוסף ביאורים נכונים לתמונות.

3. גישה ביומכנית של צמחי סחוס

  1. הכנת דוגמאות למדידות AFM
    1. תקן כל דיסק סחוס שנבחר מראש המכיל תבנית תאית (סעיף 2) בצלחות פטרי באמצעות דבק תואם ביולוגית. הוסף דבק לדוגמה מספיק בצד העליון, התחתון, השמאלי והימני של הדיסק.
    2. מכסים את הדיסקים ב-2.5 מ"ל של מדיום L-15 של לייבוביץ' ללא L-גלוטמין. מוסיפים את תווך ליבוביץ בעדינות על הדגימות כדי למנוע ניתוק דגימה מפני השטח עקב גלים שנוצרו על ידי התווך.
  2. טעינת הדגימות ל-AFM
    1. מקמו את צלחת הפטרי במחזיק הדגימות של מכשיר ה-AFM והפעילו את מחמם צלחת הפטרי המכוון ל-37°C. תנו לצלחת תרבית הרקמה להגיע לטמפרטורה הרצויה. זה נעשה כדי למנוע ממצאים אפשריים הנגרמים על ידי שינוי טמפרטורה.
  3. כיול AFM-cantilever
    1. אתחל את הגדרת התוכנה כפי שתוארה קודם לכן על-ידי Danalache et al.29.
    2. בחר מחזיק בלוק זכוכית מתאים למדידות נוזלים והנח אותו בזהירות על ראש AFM. מנגנון נעילה מאבטח את בלוק הזכוכית בראש AFM. ודא שהמשטח המחזיר אור של בלוק הזכוכית ישר ומקביל למחזיק AFM.
    3. הניחו את המזנון על פני השטח של מחזיק המגן מבלוק הזכוכית בזהירות. המזנון עצמו צריך להישען על המישור האופטי המלוטש, במרכז גוש הזכוכית.
    4. מניחים בזהירות חצאית סיליקון (קרום סיליקון) על בסיס מחזיק המגן על מנת למנוע עיבוי בינוני בראש AFM.
    5. מנמיכים את המזנון בצעדים של 100 מיקרומטר באמצעות פונקציית מנוע הצעד עד שהוא שקוע לחלוטין בתווך.
    6. הפעל גישת סורק עם פרמטרי הגישה המתוארים על ידי Danalache et al.29. משכו את המזנון ב-100 מיקרומטר ברגע שמגיעים לתחתית צלחת הפטרי.
    7. כייל את המזנון באמצעות השלבים המדויקים והפעל את הפרמטרים המתוארים על ידי Danalache et al.29. בסוף הכיול, הסטייה האנכית נשמרת ומוצגת ביחידות כוח של ניוטון (N) ולא בוולט (V) - יחידת הרישום המקורית על ידי גלאי הפוטודיודות. בניסויים כאן, נקודה קבועה של 4.47 nN התקבלה לאחר כיול.
    8. באמצעות פונקציית מנוע הצעד, משוך את המגן ל- 1,000 מיקרומטר.
  4. זיהוי אתר מדידת הסחוס הרצוי תחת AFM
    הערה: בשל עובי של 1 מ"מ של דיסקיות הסחוס, הקנה אינו נראה בשדה הראייה בעת ניווט מעל הדגימה.
    1. השתמש במצלמת CCD של המיקרוסקופ כדי לזהות את הקנטילבר. יש למקם את מיכל ה-AFM באזור נטול דגימות של צלחת הפטרי.
    2. התחל גישה של סורק עם המזנון על אזור נקי וללא דגימות של צלחת הפטרי, תוך שימוש באותם פרמטרים שתוארו על ידי Danalache et al.29.
    3. משכו עוד יותר את המגן במרחק של 1.5 מ"מ מתחתית הצלחת בעזרת בקרת מנוע הצעד. שלב זה הוא קריטי על מנת למנוע התנגשות ישירה בין הקנטיל לבין הדגימה.
    4. עבור משדה בהיר לתצוגת פלואורסצנטיות וזהה חזותית את החלק העליון של הדיסק.
    5. הזז את מחזיק דגימת ה-AFM בדיוק 2 מ"מ לכיוון מרכז הדיסק. נקודה זו נחשבת למרכז דיסק הסחוס.
    6. הפעל גישה סורק, ולאחר שמגיעים לפני השטח של דיסק הסחוס, משוך את המשטח ב -100 מיקרומטר.
  5. מדידות עקומת מרחק כוח
    1. התמקדו בתאים הממוקמים באתר המדידה הרצוי. לחץ על לחצן הפעלה כדי להתחיל את המדידות ואת יצירת עקומות מרחק הכוח במיקום היעד.
    2. קבל חמש עקומות מרחק כוח בכל אתר מדידה. משכו את הקנטיל ב-500 מיקרומטר והזיזו אותו לאתר המדידה הבא.
      הערה: נסיגת הקנטיליבר היא שלב מכריע, מכיוון שמשטח דיסק הסחוס אינו הומוגני ויש לו אי סדירות. הילוך גבוה על פני הדגימה עלול לגרום להתנגשות דרמטית, שתוביל לנזק לא רצוי לחוד/דגימה. אנו ממליצים לבחור לפחות חמישה אתרי מדידה שונים המפוזרים על פני השטח של הדיסק ולרכוש לפחות חמש עקומות מרחק כוח בכל אתר.
    3. בדוק את עקומות מרחק הכוח ושמור אותן.
  6. הערכת המודולים של יאנג באמצעות מודל ההתאמה של הרץ
    1. פתח את עקומות מרחק הכוח שנוצרו לניתוח (קובץ .jpk) בתוכנת ניתוח הנתונים באמצעות האפשרות Open a Batch of Spectroscopy Curves .
    2. בחר את דגם התאמת הרץ ולאחר מכן בחר באפשרות התאמת גמישות .
      1. האפשרות Elasticity Fit מבצעת אוטומטית את החישובים הבאים בעקומת מרחק הכוח שנבחרה: מחשבת את קו הבסיס ומפחיתה מהעקומה כולה כדי להסיר את הסטת קו הבסיס (קו הבסיס מוחזר לאפס בציר y); קובע את נקודת המגע על ידי זיהוי הנקודה שבה עקומת מרחק הכוח חוצה את קו הכוח אפס (נקודת המגע מוגדרת לאפס על ציר X); חישוב הפרדת קצה מדגם (אות הגובה של piezo חשבונאות עבור כיפוף של cantilever מופחת); ומתאימה את עקומת מרחק הכוח באופן אוטומטי לדגם שנבחר. אם תרצה, כל אחד מהשלבים הללו יכול להתבצע גם באופן עצמאי.
    3. התאימו באמצעות פרמטרי ההתאמה הבאים: יחס פואסון של 0.5 ורדיוס קצה הקנטיליבר המתאים.
      הערה: בעת שימוש במקל עם קצה כדורי, יש להשתמש במודל Hertz Fit. הקנטיליבר ששימש במחקר זה היה בעל קצה כדורי ברדיוס של 5 מיקרומטר. אנו ממליצים להתאים את עקומת מרחק הכוח עד להשגת הכוח המרבי המופעל (setpoint).
    4. בדוק חזותית את התאמת עקומת מרחק הכוח כדי לוודא נכונות. שלב זה צריך להיעשות עבור כל אחת מעקומות מרחק הכוח שנותחו.
  7. קביעת עומק הזחה
    הערה: בהתאם לכלי ניתוח הנתונים שבו נעשה שימוש, תהליך זה עשוי להשתנות. הנסיין יכול לקרוא בקלות את עומק הכניסה על ידי ביצוע סדרה של צעדים הכלולים בתוכנית ניתוח הנתונים.
    1. פתח כל אחת מעקומות מרחק הכוח שנוצרו בתוכנת ניתוח הנתונים ובחר את Hertz fit Model כתהליך הניתוח.
    2. החילו את האפשרות ' הסט מקו בסיס' 'הפחת ' על אפס ציר הסטייה האנכית (ציר y) ובחרו בפונקציה 'הסטה + הטיה '.
    3. השתמש בפונקציה Find Contact Point כדי לזהות באופן אוטומטי את נקודת המגע, המועברת באופן אוטומטי לקואורדינטת x של אפס.
    4. הפחת את המרחק תוך התחשבות אך ורק בסטייה מגובה הפיזו הגולמי במהלך הכניסה באמצעות הפונקציה מיקום קצה אנכי .
    5. בחרו באפשרות 'התאמת גמישות ' להצגת עקומת מרחק הכוח המעובדת ובחרו באזור התרשים כך שהוא יתיישר עם הערך השלילי ביותר בציר מיקום הקצה האנכי (ציר x).
    6. קרא ותעד את הכניסה מהתיבה X Min בכרטיסיית הפרמטרים. שמור ותעד את התוצאות.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח את התוכנה הסטטיסטית. בחר ערכת נתונים חדשה מהתפריט הנפתח.
  2. פתח את הכרטיסייה תצוגת משתנים לאחר בחירת קובץ ערכת הנתונים . הגדירו את המשתנים המספריים לכל קטגוריית תבניות תאיות: מחרוזות בודדות = SS, מחרוזות כפולות = DS, אשכולות קטנים = SC, אשכולות גדולים = BC, מפוזרים ומודולים של יאנג.
  3. בכרטיסייה תצוגת נתונים, הזן את נתוני המודולים של יאנג הנמדדים עבור כל אחת מקטגוריות התבניות הסלולריות המתאימות. נתח את התפלגות הנתונים על-ידי בחירה באפשרות נתח משורת התפריטים ולאחר מכן ניתוח נתונים גישוש.
  4. בחר מודולי יאנג כמשתנה התלוי ותבנית תאית כרשימת הגורמים. תרשים תיבה המשמש למקטע התוצאות מוצג בין התוצאות בקובץ הפלט.
  5. לביצוע ניתוח סטטיסטי, בחרו 'דגימות תלויות' באזור 'בדיקה לא פרמטרית' בכרטיסיית שורת התפריטים 'נתח'. בחר מודולי יאנג כשדות בדיקה ותבנית סלולרית כקבוצות תחת הכרטיסיה שדות. לחץ על הפעל.
    הערה: התוצאות מוצגות בקובץ הפלט. לצורך הניתוח הסטטיסטי מבוצע מבחן פרידמן.
  6. שלב את ערכי ה-p של הבדיקה הלא-פרמטרית בתרשים התיבה שנוצר בשלב 4.4. שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על קובץ בשורת התפריטים ובחירה באפשרות שמור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות מכשיר חיתוך מתוצרת עצמית, הצלחנו לשתול וליצור דיסקיות סחוס קטנות (4 מ"מ x 1 מ"מ) מקונדילים אנושיים טריים המכילים תבנית מרחבית תאית אחת30 של מיתרים בודדים (SS, איור 2A), מיתרים כפולים (DS), אשכולות קטנים (SC), אשכולות גדולים (BC; איור 2A), ומפוזר (איור 2B). חציל סחוס מייצג מתואר באיור 3A. בחירת הדיסקים המציגים רק סוג אחד של תבנית נעשתה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מלמעלה למטה (איור 2). השונות הטופוגרפית של דיסקת פני השטח של הסחוס הודגמה עוד יותר על-ידי הדמיה צדדית של מקטעים בעובי 60 מיקרומטר שנוצרו מדיסקי הסחוס (איור 2C). על פני השטח של דיסקי הסחוס האוסטאואריטי שנשתלו נמצאו פרפור שטחי ושסע מטריקס (איור 3B,C). זה בלט במיוחד בדיסקים המייצגים התקדמות OA מתקדמת – המיוצגת על-ידי נוכחות BC (איור 2A). לאחר מיון פוסט-פלואורסצנטי, קשיחות הדיסקים הוערכה על ידי מיקרו-כניסות AFM. לשם כך, דיסקיות הסחוס שנוצרו קובעו בהצלחה בצלוחית פטרי AFM באמצעות דבק תואם ביולוגית (איור 3D) כדי למנוע היסחפות דגימות במהלך המדידות (איור 3E). יש להתאים את כמות הדבק בה משתמשים. כמות לא מספקת של דבק תגרום לאי יציבות דיסק, בעוד שהוספת דבק רב מדי עלולה להוביל לפיזור לא רצוי של הדבק מתחת ו/או מעל דיסק הסחוס. זה האחרון מוביל לממצאי מדידה וזיהוי לקוי של הדיסק תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. יישום דבק לקוי או תנועות פתאומיות של הדגימה במהלך הקיבוע הן בעיות תכופות הגורמות לרקמה להתנתק מצלחת הפטרי ויש להימנע מהן.

הפחתה הדרגתית מייצגת של הנוקשות לצד סידור התבניות התאיות מוצגת באיור 4A. ערכי הנוקשות היו גבוהים יותר בדיסקים שהכילו SS (חציון של 2.6 kPa) - המייצג אזורי סחוס היתולי שלא נפגעו. עם תחילת OA והתקדמותו, מדידות AFM הראו ירידה חזקה בקשיחות הדרגתית של 42% ב- DS (1.5 kPa), 77% ב- SC (0.6 kPa), ובסופו של דבר, 88% בשלבים מתקדמים המיוצגים על ידי BC (0.3 kPa; איור 4A). הדיסקים שהכילו תבנית דיפוזית הציגו גמישות גבוהה עם וריאציה חשובה של ערכי היחיד המודולוס של יאנג. עבור כל דיסקי הסחוס שהוקצה להם ארגון תבנית תאית דומיננטית, עומק ההזחה הקשור לנקודת הסט המועסקת (4.477 nN) נמצא ביחס הפוך לנוקשות (איור 4B). עקומת מרחק כוח מייצגת מוצגת באיור 4C, והתאמה של הרץ כמו גם זיהוי נקודת המגע מוצגים באיור 4D.

ההתאמה הנכונה תלויה, בין היתר, בקביעה הנכונה של קו הבסיס. אם זיהוי קו הבסיס האוטומטי שגוי (לדוגמה, עקב קו בסיס סוער), ניתן לקבוע את ההתאמה גם באופן ידני, והוא מאפשר למשתמש לבחור קו בסיס מייצג יותר עבור המדידות. עם זאת, אם עקומת מרחק הכוח הנוצרת אינה מאפשרת התאמה נכונה, יש להיפטר ממנה. איור 5 מציג דוגמאות לעקומות כוח שגויות של מרחק. יצירת עקומות כוח מתאימות למרחק על צמחי סחוס מפרקי אוסטיאוארטריטי יכולה להיות קשה בגלל פני השטח הלא סדירים של הרקמה, מצד אחד (דוגמאות מוצגות באיור 5A,B), וחוסר היציבות של הדגימה שנגרם כתוצאה מקיבוע דגימה לא נכון (דוגמאות מוצגות באיור 5C,D). ממצאים עשויים להיגרם על ידי נקודות מגע מרובות של דגימת בדיקה (עקב פני השטח הלא אחידים של סחוס מנוון) או תנועת רקמות לא רצויה (הנראית דרך שינויים במישור המוקד). ניתן לראות ממצאים אלה בעקומות מרחק הכוח שנוצרו, והם מעידים על מגע תת-אופטימלי בין משטח ה-AFM לבין משטח הסחוס או על קיבוע דגימה לא תקין לצלחת הפטרי (ראו איור 5A-D).

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של הליך הניסוי. סיכום שלבי הניסוי בסדר כרונולוגי, החל מדגימות סחוס תוך ניתוחיות ועד ליצירת דיסקיות סחוס בגודל 4 מ"מ x 1 מ"מ, צביעת פלואורסצנטיות ומיון הדיסקים על בסיס ארגון התבנית התאית באמצעות הדמיה מלמעלה למטה ומבט מהצד, ולבסוף הערכת אלסטיות באמצעות מדידות כוח אטומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה פלואורסצנטית של דיסקי סחוס מייצגים . (A) תמונות פסיפס דו-ממדיות ושדה מופתי מוגדל של דיסקיות סחוס מוכתמות בצבע חדיר לקרום התא בהגדלה של פי 100. הדיסק העליון מציג דיסק מיתרים יחיד מייצג, ואילו התחתון מייצג דיסק אשכול גדול (למטה). (B) תמונת פסיפס של דיסק דפוס מפוזר הנראה מפני השטח (למעלה), ואותו דיסק מצולם מצדו התחתון (למטה). (C) מבט מהצד על צביעה גרעינית של פרוסות 60 מיקרומטר של דיסקיות סחוס. סרגל קנה המידה הלבן מייצג 500 מיקרומטר עבור תמונות הפסיפס (שדה ראייה גדול יותר, A [לוח שמאלי], B, C) ו- 100 מיקרומטר עבור התמונות המוגדלות והממוקדות (A [לוח ימני]). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דיסקיות סחוס מפרקי מושתלות. (A) תמונה מייצגת של דיסק סחוס שנוצר בגודל 4 מ"מ x 1 מ"מ מסחוס מפרקי אנושי טרי. סרגל קנה המידה המתואר בלבן מייצג 2 מ"מ. (B) תמונה מייצגת של סחוס אוסטיאוארטריטי מקומי שבו פני הרקמה מציגים פרפור שטחי ושסע מקרוסקופי גלוי. סרגל קנה המידה המתואר בלבן מייצג 1,000 מ"מ. (C) תיאור סכמטי של משטח הסחוס הפרפור. (D) לפני מדידות AFM, כל אחד מעציצי דיסק הסחוס היה קבוע כראוי באמצעות דבק דגימה תואם ביולוגית לפני השטח של צלחת פטרי AFM כדי למנוע ממצאים עקב נדידת הדגימה במהלך מדידות ההזחה בפועל כמוצג ב-(E). סרגל קנה המידה הלבן מייצג 4 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של מדידות במיקרוסקופ כוח אטומי של דיסקות סחוס מפרקי שמוינו על בסיס ארגון התבנית התאית הדומיננטית שלהם . (A) Boxplot המציג את החציון של המודולים המחושבים של יאנג של חמישה דיסקים, אחד לכל תבנית תאית, שמקורם במטופל אחד. סה"כ בוצעו 25 מדידות על כל דיסק (חמש מדידות לחמישה אתרי מדידה שונים). הקו השחור בתוך המלבן מייצג את הערך החציוני, הגפיים התחתונות והעליונות של המלבן מייצגות את הרביעון הראשון והשלישי, בהתאמה, וקווי השגיאה מייצגים את הערכים הנמוכים והגבוהים ביותר עבור כל קבוצה. (B) תרשים נקודתי המתאר את 125 נקודות עומק הכניסה עבור כל תבנית תאית. (C) עקומות כוח מופתיות שנרכשו עם AFM עם מודולוס יאנג מחושב של 0.4 kPa. (D) קביעת התאמה ונקודת מגע מייצגת של הרץ עבור עקומת מרחק הכוח המוצגת ב-(C). ציר x מציג את מיקום הקצה האנכי (שהוא המרחק שחוצה הפיזו, כאשר האורך לוקח בחשבון את כיפוף הקנטיליבר מופחת אוטומטית מחלק המגע של עקומת מרחק הכוח). *P < 0.05. לצורך ניתוח סטטיסטי נעשה שימוש במבחן פרידמן. קיצורים: SS = מחרוזות בודדות; DS = מחרוזות כפולות; SC = אשכולות קטנים; BC = אשכולות גדולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמאות לעקומות כוח מרחק שגויות . (A) עקומת מרחק הכוח מראה סטייה מסיבית ואחריה התאוששות קרוב לרמת קו הבסיס לפני שנצפתה הזחה רציפה של פני השטח. ניתן לייחס תופעה זו למכשול גדול יחסית (למשל, שסעים גדולים הבולטים מהשכבה העליונה של הסחוס). (B) עקומת מרחק הכוח המורחבת מראה פסגות קטנות מרובות. עקומות אלה נחשבות כנגרמות על ידי אי סדירות בקנה מידה מיקרו על פני הסחוס (למשל, פרפור). גם (C) וגם (D) מציגות עקומות מרחק כוח עם מסלולים דו-פאזיים. שתי עקומות מרחק הכוח מייצגות קיבוע מדגם לקוי וסחף דגימה. זה גם די נפוץ במקרים אלה לראות שינוי פתאומי במישור המוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמחלה מתקדמת ורב-גורמית, OA מעוררת שינויים מבניים ותפקודיים בסחוס המפרקי. במהלך OA, ליקויים בתכונות מכניות מלווים בשינויים מבניים וביוכימיים על פני השטח של הסחוס המפרקי27,31. האירועים הפתולוגיים המוקדמים ביותר המתרחשים ב- OA הם דלדול פרוטאוגליקן יחד עם הפרעה ברשת הקולגן32,33,34. קשה לאתר ולזהות שינויים מוקדמים כאלה על פני השטח באמצעות בדיקות בתפזורת, מכיוון שההתנהגות המכנית ממוצעת על פני כל עומק הרקמה. בנוסף, שאלה שעדיין לא טופלה היא האם שינויים תפקודיים ברמת האיבר והרקמות קשורים לשינויים מבניים ותפקודיים בקנה מידה מיקרו או ננומטרי. לשם כך, AFM נחשבת לאחת השיטות הרגישות ביותר, המסוגלות לזהות את השינויים הביומכניים המוקדמים ביותר המתרחשים עם הופעת OA7. הוא מאפשר מדידות קשיחות בסקאלות מיקרו וננומטר בדגימות מקומיות, ומספק מידע על התכונות המכניות של סחוס מפרקי35,36. בפרוטוקול זה, באמצעות כניסות מיקרו-AFM, מדדנו את התכונות האלסטיות של סחוס מפרקי בריא ואוסטיאואריטי של צמחים אנושיים. התוצאות הראו כי צמחי הסחוס מייצגים מאוד אירועי OA מקומיים מוקדמים עם ירידה הדרגתית ניכרת בנוקשות המתרחשת בצמחי סחוס ספציפיים לדפוס. יתר על כן, התוצאות תואמות מחקרים קודמים שפורסמו שהראו ירידה ניכרת בנוקשות לצד ארגון הדפוס התאי 23,24,27,37.

מודלים אנושיים ילידים מאומתים המחקים היבטים שונים של פתוגנזה והתקדמות OA נדרשים כיום כדי להתמודד עם החסרונות של מחקר תרגומי והאתגרים של תרגום נתונים במבחנה לסביבה קלינית. נכון להיום, אף מודל אינו יכול לייצג במדויק את תא הסחוס האנושי הטבעי המורכב, שלא לדבר על רקמות המפרקים הקשורות לגיל המועדות ל-OA בתגובה לגירויים מחוללי מחלה38. המודלים הנפוצים ביותר המבוססים על צמחים עד כה היו ממקור בקר או בקר והשתמשו בטיפול בציטוקינים דלקתיים חזקים או בהעמסה מכנית 39,40,41. פרוטוקול זה, בצד השני, מדגים כיצד לייצר דגימות סחוס אנושיות קטנות (4 מ"מ x 1 מ"מ) בצורת דיסק, המעידות על השלבים הבודדים של אירועי OA ספציפיים. צמחי הסחוס ממוינים ומוקצים לשלב באמצעות הארגון המרחבי התאי כסמן ביולוגי מבוסס תמונה30,42. מכיוון שניתן לזהות ולכמת שינויים מוקדמים בתכונות ביומכניות כבר ברגע שמחרוזות כפולות מתחילות להופיע23,27, בשלב שבו משטח הסחוס עדיין נראה שלם מבחינה מקרוסקופית 26, מודל מבוסס צמחים זה מאפשר לחקור תא סחוס מקומי מקומי ועשוי לספק מידע תובנה על OA מוקדם. יתר על כן, מודל סחוס זה יכול להיות שימושי בחקירת התאים ותגובת המטריקס לשינויים מכניים ודלקתיים בסביבת מחיה מקומית תלת-ממדית38,39. בהיותם פשוטים יחסית וקלים לייצור, צמחי סחוס אלה יכולים לשמש גם לחקר הטרוגניות OA, שהיא גורם מגביל בפיתוח ובדיקה של תרופות OA משנות מחלה43. כמו כן, יש לציין כי סקלביליות ותלות בחולים העוברים ניתוח החלפת מפרק הם שניים מחסרונותיו של המודל.

זה ידוע היטב כי סחוס מפרקי מציג התנהגות מוזרה בהתאם לרמת קנה המידה הנבדק. כפי שצוין על ידי Loparic et al., בקנה מידה מיקרו, הסחוס מתנהג כחומר לא מובנה ואחיד35, וגישה כזו נותנת קירוב של קשיחות סחוס כוללת מקומית. באשר לשאלה האם מיקרו-כניסות או ננו-כניסות מתאימות יותר, מחקר שנערך בשנת 2004 על ידי Stolz et al.44 השווה כניסות בקנה מידה מיקרו וננומטרי בהערכת התכונות המבנה-מכניות של הסחוס המפרקי. המחברים הדגישו כי עבור הזחה כדורית בקנה מידה מיקרו של הסחוס המפרקי, המרכיבים המבניים העדינים בקנה מידה ננומטרי (כלומר, סיבי קולגן בודדים ופרוטאוגליקנים) חולקים בדרך כלל את המשימה של נשיאת עומס. בכך, התכונות המכניות המצרפיות שונות במידה ניכרת מאלה של הננו-רכיבים הבודדים. אותם מחברים הציעו כי ניתן להשתמש בשילוב של מיקרו וננו-כניסות כדי להעריך את פרופילי הנוקשות המקומיים הכוללים של הסחוס המפרקי, כמו גם את הנוקשות הקשורה לרכיבים המבניים העדינים44.

ניסויי הזחה רבים מבוססי AFM השתמשו בקצוות פירמידליים חדים (רדיוס = 15-20 ננומטר)22,36,44 להערכת מכניקת הסחוס. אף על פי שהננו-כניסות עם קנטילברים חדים נחשבות כיום למתאימות יותר להערכת התכונות המכניות הטובות ביותר, קצוות כדוריים מפיקים תוצאות עקביות יותר וקלות יותר למדל ולפרש בעת בדיקת דגימות ביולוגיות רכות44,45. יתר על כן, סטולץ ועמיתיו הראו כי ננו-כניסות AFM של סחוס מפרקי מפורק אנזימטי (כלומר, אלסטאז) אינן אפשריות מכיוון שהרקמה הופכת כה דביקה עד כי הידבקות דגימת קצה שולטת בעקומות מרחק הכוח, מה שהופך את הנתונים לבלתי אפשריים44.

במדידות AFM הנוכחיות נעשה שימוש בקנטיליבר בעל קצה כדורי ברדיוס של 5 מיקרומטר. הבחירה נבעה מהכוונה לחשב את התכונות המכניות של הרקמה על פני משטח גדול למדי תוך מזעור הנזק שנגרם למשטח הסחוס. הקשר בין הכוח המופעל על ידי הקנטילבר לבין כניסת הדגימה המתקבלת הותאם למודל ההתאמה של הרץ. בעת שימוש בכניסות כדוריות, מומלץ להשתמש במודל ההתאמה של הרץ, כאשר הכוחות המושכים הפועלים בין קצה הפתח למשטח הדגימה מוזנחים46. המשוואות עבור המודל ההרציאני מוצגות ב-Eq.1 וב-Eq.2.

Equation 1Eq.1

Equation 2Eq.2

כאשר F = כוח; E = המודולוס של יאנג; v = היחס של פואסון; δ = הזחה; A = רדיוס מעגל המגע; ו - Rs = רדיוס הכדור.

המודל מחשב בסופו של דבר את גמישות התא/רקמה47, המבוטאת באופן רשמי כמודולוס יאנג (E). מודל ההתאמה של הרץ לוקח בחשבון מספר מאפיינים כגון צורת קצה וגודל, הזחה ועיוות דגימה. אם דרישות אלה אינן מתקיימות באופן אידיאלי, המודל עשוי לספק הערכה לא מדויקת של מודולוס46 של יאנג.

מודל ההתאמה של הרץ מניח שהמתח והלחץ האלסטי תלויים באופן ליניארי במודולוס האלסטי, מה שמרמז על כך שהשקע בדגימה נשאר קטן בהרבה מעובי הדגימה עצמה46. הנחה זו הושגה בקלות במערך זה, שבו עציצי הסחוס היו בעובי של 1 מ"מ לעומת שקעים של מיקרומטרים בודדים.

סחוס מפרקי יכול להיות מודל כחומר ויסקו-אלסטי נקבובי48,49. ההתנהגות הוויסקו-אלסטית נובעת מחיכוך בין המרכיבים התוך-תאיים/ציטופלזמיים או מטריצות כגון מולקולות, אברונים ורשת קולגן-פרוטאוגליקן50,51. כפי שהשם מרמז, חומרים ויסקו-אלסטיים משלבים שתי תכונות נפרדות: צמיג - החומר מתעוות לאט כאשר הוא נתון לעומס חיצוני - ואלסטי - החומר חוזר לתצורתו הראשונית לאחר הסרת העומס המופעל52,53. ההתנהגות הוויסקו-אלסטית מתבטאת בהיסטרזה בין עקומות הגישה (המורחבת) לבין עקומות הנסיגה בעקומות מרחק הכוח 46,52, בדומה לעקומות שהתקבלו במחקר זה (איור 4C). יתר על כן, מאפיין של חומרים ויסקו-אלסטיים הוא שתכונותיהם המכניות תלויות בקצב העיוות, כאשר קשיחות החומר עולה עם קצב הפעלת ההעמסה (מהירות הזחה)54. כך, על ידי בחירת קצבי העמסה שונים, נוצרת משפחה של עקומות מרחק כוח, שכל אחת מהן מייצגת את התכונות המכניות של המדגם הנבדק בכל קצב העמסה52. לכן, כאשר מנסים להשוות את התוצאות של עבודות שונות, זה קריטי לקחת בחשבון את כל הפרמטרים של הזחה. בסך הכל, כאשר מודדים בסקאלה מיקרומטרית (כמו במחקר זה עם קצה כדורי של 5 מיקרומטר), הסחוס המפרקי מתנהג כחומר לא מובנה ואחיד, ויוצר מודולוס אלסטי מצטבר הכולל תרומות אלסטיות וצמיגיות לנוקשות בשל האופי הפורוביסקואלסטי של הרקמה35.

הנחה נוספת של המודל ההרציאני היא שעומק ההזחה נמוך מרדיוס קצה הפתח הכדורי55. עומק ההזחה מייצג את התזוזה המרבית של קצה הפתח לאחר מגע ראשון עם הדגימה. בעומס מרבי, עומק הכניסה המרבי הוא התזוזה הכוללת של הדגימה וקצה המזח. הקו המנחה של Bueckle קובע עומק כניסה מקסימלי של 10% מהעובי הכולל של דגימה עם אותו מבנה לאורך56, אחרת, התוצאות משתנות בהתאם ליחס עומק לעובי. עבור רדיוס קצה של 5 מיקרומטר, צמחי הסחוס במחקר זה הושקעו בממוצע של 1.1 מיקרומטר, עם כמה פסגות של 3 מיקרומטר בכמה מקרים, במיוחד עבור צמחי הסחוס המנוונים מאוד. במקרה זה התבקשה פשרה, שכן במסגרת הניסוי נדרשים כוחות גבוהים יחסית הקשורים לכניסות גדולות כדי לנטרל את אי הסדירות על פני השטח של סחוס מנוון. הזחה קלה יותר תביא לבדיקת פרפור שטחי ובקיעת קולגן, שניהם מאפיינים נפוצים של סחוס מנוון מאוד57.

קריטי עבור מודל ההתאמה של הרץ הוא גם זיהוי נכון של הנקודה שבה קצה הקנטיל בא במגע ישיר עם הדגימה, המכונה באופן גנרי נקודת המגע. עם זאת, הדבר עלול להתברר כבעייתי בעת הזחה של דגימות דביקות מדי או רכות מדי, מכיוון שהוא עלול לגרום למספר נקודות מגע של דגימת בדיקה58,59. למעשה, כפי שהדגישו יפה א-חסן ואחרים, עבור רקמות ביולוגיות רכות, הקביעה המדויקת של נקודת המגע היא אחת הבעיות המטרידות ביותר60 . השפעה זו נצפתה גם בצמחי הסחוס האוסטיאוארטריטיים המקומיים, שכן בהתאם לשלב הניוון, משטח הרקמה מאבד את המאפיינים המכניים הטבעיים שלו ולעתים קרובות אינו אחיד, ומציג פרפור ושסע שטחיים (איור 3B,C). התופעה הזו נצפתה במיוחד בצמחי הסחוס שבהם התבנית התאית הדומיננטית הייתה צבירים גדולים (איור 2C). אי-הומוגניות זו במשטח הסחוס עלולה להוביל למספר נקודות מגע של דגימת בדיקה, ולכן לתוצאות שגויות. בחלק מהמקרים נצפו סטיות עצומות, ולאחריהן התאוששות מהירה של קו הבסיס לפני הישורת האחרונה של עקומת מרחק הכוח (איור 5A). ניתן לייחס זאת למכשול גדול בנתיב קצה הפתח (למשל, אזורי פרפור מתקדמים עם סחוס מתפורר ומתפצל). במקרים אחרים, השיפוע הסופי של עקומת מרחק הכוח היה מפוזר עם אי-סדירות קטנה יותר (איור 5B), מה שמצביע על מגע עם מכשולים קטנים יותר (למשל, מיקרו-פרפור של הרקמה). במקרים כאלה, יש למדוד מחדש או אפילו לשנות את אתר המדידה כדי להבטיח אמינות נתונים ויכולת שחזור. לשם כך, חשוב גם לבדוק היטב את פלט עקומת מרחק הכוח של AFM לזיהוי נכון של נקודת המגע. זוהי נקודה קריטית שיש להיות מודעים אליה, שכן הוכח כי זיהוי שגוי של נקודת המגע על ידי 50 ננומטר גורם הערכה שגויה של הערך של E בסדר גודלשל 61. מספר מחקרים החלו להשתמש בגישות אוטומטיות כדי לקבוע את נקודת המגע של עקומות מרחק כוח, במטרה לעקוף קלט משתמש סובייקטיבי בעת הערכת נקודת המגע על ידי בדיקה חזותית ושיפור הדיוק. זה הופך להיות אפילו יותר קריטי כאשר מתמודדים עם מספר רב של עקומות תזוזת כוח, כגון אלה שנוצרו במכניקת התא mesurements47,62. למרות שהוצעו מספר אסטרטגיות לאוטומציה של קביעת נקודת המגע 47,63,64,65, האסטרטגיה האופטימלית תלויה מאוד בתנאי הניסוי ובגורמים כגון המודל המשמש לניתוח הנתונים, צורת הגשושית, האינטראקציה המכנית (הלא) דבק בין קצה הקנטיל לדגימה, כמו גם ההתנהגות (הלא) הרציאנית של המדגם 63.

סטיית דגימות היא בעיה נפוצה נוספת שעלולה לגרום לממצאים ולקביעת נקודת מגע שגויה (איור 3E). זה בעצם אומר שהדגימה אינה מותקנת כראוי במחזיק הדגימה (צלחת פטרי) והדגימה נעה במהלך מדידות AFM. ההשפעה בולטת במיוחד בעת העברת ה-AFM לאתר מדידה חדש. היבט זה ניתן לראות בקלות במהלך המדידות בפועל על ידי שינוי פתאומי במישור המוקד. לעקומות מרחק הכוח המתקבלות יש בדרך כלל שיפוע דו-פאזי מורחב, עם עלייה מתונה בהתחלה, המקבילה להיצרות החלל הריק בין תחתית הדיסק לצלחת הפטרי כאשר הדיסק נדחף מטה על ידי הקנטיליבר (ראה איור 3E), ולאחר מכן נטייה מוצקה יותר בחלק השני של המדרון, מה שמצביע על כך שהדיסק מוסט פנימה עוד יותר עכשיו, כשהוא נמצא במגע ישיר עם תחתית צלחת הפטרי (איור 5C,D). כדי להתגבר על העיוותים, אפשר לנסות לתקן טוב יותר את הדגימות על-ידי שימוש בדבק דגימה מתאים (איור 3D), שמירה על טמפרטורה קבועה על-ידי כיבוי מקורות חום חיצוניים (אורות) כדי למנוע סחף תרמי, וביצוע מדידות סריקה מהירות. בניסויים כאן, הבחנו בסחף סטיית הקנטיל שהתרחש בתוך 15 הדקות הראשונות של טבילת הקנטיליבר במדיה (עקב שינויים פתאומיים בטמפרטורה). לאחר חלוף זמן זה, הסחף הוא בדרך כלל זניח. כתוצאה מכך, אנו ממליצים לנסיין לבחון היטב את קו הבסיס לאחר טבילת הקנטיליבר ולהתחיל למדוד לאחר התייצבותו. משך התהליך יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לכלי המשמש.

פרמטר קריטי נוסף לכל מדידת AFM הוא נקודת ההגדרה, שהיא, באופן פשטני, מדד של הכוח המופעל על ידי הקנטיל על המדגם. עבור מצב המגע (כפי שנעשה בו שימוש במחקר זה), נקודת ההגדרה מייצגת סטייה מסוימת של הקנטילבר. בעת ביצוע מספר סריקות או מספר חזרות באתר, כמו בפרוטוקול כאן, קצה הקנטיליבר יכול לספוח חלקיקים משטח הדגימה, ולכן לעיתים יש צורך להסיר את הקנטיליבר, לנקות אותו כראוי66, ולאחר מכן לכייל מחדש לפני שממשיכים במדידות.

בעוד שמיקרו-כניסות AFM מספקות הזדמנויות חדשות ומעניינות לאיסוף נתונים, במיוחד בהקשר של סחוס אוסטאוארתריטי, העקביות ויכולת השחזור של הנתונים המיוצרים תלויים במידה רבה במספר פרמטרים, כפי שתואר לעיל. כאשר משתמשים בגישה זו כדי להעריך את השינויים המכניים הנגרמים על ידי ניוון רקמת הסחוס, יש לבצע תחילה כמה מדידות פיילוט על תבניות מרחביות שונות על מנת להגדיל את התוצאות לתכנון הניסוי הספציפי. מדידות AFM ניסיוניות צריכות להתבצע עם ההליך הסטנדרטי ביותר לקיחת מספיק דגימות (למשל, חמישה דיסקים) של אותו דפוס כדי לספק אינדיקציה למידת השונות של הנתונים. זה חשוב במיוחד כאשר מנסים לכמת ולהעריך את השינויים הרלוונטיים המוקדמים ביותר בנוקשות OA (כלומר, בין מחרוזות בודדות ומחרוזות כפולות, איור 4A). למעשה, במחקר קודם, בגישה דומה, הראינו כי גודל מדגם של 30 דגימות אנושיות נדרש כדי להעריך שינויים ביומכניים במטריצה כפונקציה של הארגון המרחבי של התאים37.

יתר על כן, רבים מהצעדים המוצגים בפרוטוקול זה חשופים לטעויות אנוש ומסתמכים במידה רבה על ניסיונו של המפעיל. בהתחשב בכל הגורמים שיכולים להשפיע על תוצאות AFM בפועל, ערכי E המוחלטים שדווחו במחקר זה אינם ניתנים להכללה והם ספציפיים למדי למערך ניסוי זה. עם זאת, הקשר המוצג כאן בין המודולים השונים של יאנג לבין צמחי הסחוס מבוססי התבנית התאית (ככל שהתבנית המרחבית פתולוגית יותר, כך המודולוס האלסטי [EM] של הסחוס נמוך יותר) אינו מושפע, שכן הממצאים עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו שינויים בנוקשות כפונקציה של ארגון התבנית התאית23,37.

בסך הכל, פרוטוקול שלב אחר שלב זה מדגים את הפונקציונליות של צמחי סחוס מפרקי תלת-ממדיים מקוריים מתוקננים, אשר לא רק מייצגים אירועי ארגון מחדש של תאים המונעים על-ידי OA, החל מהתחלה ועד התקדמות מתקדמת, אלא גם קשורים לירידה הדרגתית בנוקשות. הצמחים עשויים לשקף מודל ביומימטי אמין לחקר הופעת OA והתקדמותו, המאפשר בדיקה ופיתוח של שיטות טיפול שונות ex vivo. השימוש במודל אקספלנט אנושי כזה בשילוב עם הערכה ביומכנית מבוססת AFM יכול לגרום לשינוי פרדיגמה במחקר הביו-רפואי ובתעשיית התרופות, ולסלול את הדרך לדרכים חדשות לזהות תרופות OA יעילות הנחוצות מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למנתחים האורתופדיים מהמחלקה לכירורגיה אורתופדית בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן על מתן דגימות הרקמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Tags

נסיגה גיליון 188 חצילי סחוס מפרקי מיקרוסקופ כוח אטומי מודולי אלסטי מודל ex vivo הזחת מודל הרץ הכנת רקמות
טיפול בסוגיות מעשיות במיקרו-הזחה מבוססת מיקרוסקופיה של כוח אטומי על צמחי סחוס מפרקיים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, C., Alexander, D., Umrath,… More

Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter