Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Summary

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Abstract

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en tilapia (Oreochromis spp.) landbouw vormt de belangrijkste zoetwatervisvariëteit die wordt gekweekt. Omdat aquacultuurpraktijken gevoelig zijn voor microbiële besmetting afgeleid van antropogene bronnen, is uitgebreid antibioticagebruik nodig, wat ertoe leidt dat aquacultuursystemen een belangrijke bron worden van antibioticaresistente en pathogene bacteriën van klinische relevantie, zoals Escherichia coli (E. coli). Hier werden de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam , hersteld van in het binnenland gekweekte Oreochromis spp., opgehelderd door middel van whole-genome sequencing (WGS) en in silico-analyse . Antimicrobiële gevoeligheidstests (ASAT) en WGS werden uitgevoerd. Bovendien werden fylogenetische groep, serotype, multilocussequentietypering (MLST), verworven antimicrobiële resistentie, virulentie, plasmide en profaaginhoud bepaald met behulp van diverse beschikbare webtools. Het E. coli-isolaat vertoonde alleen intermediaire gevoeligheid voor ampicilline en werd gekarakteriseerd als ONT:H21-B1-ST40-stam door op WGS gebaseerde typering. Hoewel slechts één antimicrobieel resistentie-gerelateerd gen werd gedetecteerd [mdf(A)], werden verschillende virulentie-geassocieerde genen (VAGs) van het atypische enteropathogene E. coli (aEPEC) pathotype geïdentificeerd. Bovendien werd de lading plasmide replicons uit grote plasmidegroepen en 18 profaag-geassocieerde regio’s gedetecteerd. Kortom, de WGS-karakterisering van een aEPEC-isolaat, hersteld van een viskwekerij in Sinaloa, Mexico, biedt inzicht in het pathogene potentieel en het mogelijke risico voor de menselijke gezondheid van het consumeren van rauwe aquaculturele producten. Het is noodzakelijk om next-generation sequencing (NGS) technieken te gebruiken voor het bestuderen van micro-organismen in het milieu en om een één gezondheidskader aan te nemen om te leren hoe gezondheidsproblemen ontstaan.

Introduction

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en de productiepraktijken zijn bedoeld om te voldoen aan de stijgende vraag naar voedsel voor menselijke consumptie. De wereldwijde aquacultuurproductie is verdrievoudigd van 34 miljoen ton (Mt) in 1997 tot 112 Mt in 2017¹. De belangrijkste soortengroepen, die bijdroegen aan bijna 75% van de productie, waren zeewier, karpers, tweekleppigen, meervallen en tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Het verschijnen van ziekten veroorzaakt door microbiële entiteiten is echter onvermijdelijk vanwege de intensieve viskweek, wat leidt tot potentiële economische verliezen².

Antibioticagebruik in viskweekpraktijken staat bekend om het voorkomen en behandelen van bacteriële infecties, de belangrijkste beperkende factor in productiviteit ^3,4. Niettemin hopen residuele antibiotica zich op in aquacultuursedimenten en water, waardoor selectieve druk wordt uitgeoefend en de vis-geassocieerde en de verblijvende bacteriële gemeenschappen worden gewijzigd 5,6,7,8. Bijgevolg dient de aquacultuuromgeving als reservoir voor antimicrobiële resistentiegenen (ARG’s) en de verdere opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën (ARB) in het omringende milieu⁹. Naast de bacteriële pathogenen die vaak worden waargenomen bij het kweken van vissen, worden leden van de Enterobacteriaceae-familie vaak aangetroffen, waaronder menselijke pathogene stammen van Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. en Salmonella spp.10. E. coli is het meest voorkomende micro-organisme geïsoleerd uit vismeel en water in de viskweek 11,12,13,14,15.

E. coli is een veelzijdige gramnegatieve bacterie die het maagdarmkanaal van zoogdieren en vogels bewoont als een commensaal lid van hun darmmicrobiota. E. coli bezit echter een zeer adaptief vermogen om te koloniseren en te volharden in verschillende milieuniches, waaronder bodem, sedimenten, voedsel en water¹⁶. Vanwege de genwinst en -verlies door het fenomeen horizontale genoverdracht (HGT), is E. coli snel geëvolueerd tot een goed aangepast antibioticumresistente ziekteverwekker, die een breed spectrum van ziekten bij mens en dier kan veroorzaken^17,18. Op basis van de oorsprong van de isolatie worden pathogene varianten gedefinieerd als intestinale pathogene E. coli (InPEC) of extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC). Bovendien zijn InPEC en ExPEC onderverdeeld in goed gedefinieerde pathotypes op basis van ziektemanifestatie, genetische achtergrond, fenotypische eigenschappen en virulentiefactoren (VFs)16,17,19.

Traditionele kweek- en moleculaire technieken voor pathogene E. coli-stammen hebben de snelle detectie en identificatie van verschillende pathotypen mogelijk gemaakt. Ze kunnen echter tijdrovend, bewerkelijk en vaak een hoge technische training vereisen¹⁹. Bovendien kan geen enkele methode worden gebruikt om alle pathogene varianten van E. coli betrouwbaar te bestuderen vanwege de complexiteit van hun genetische achtergrond. Momenteel zijn deze nadelen overwonnen met de komst van high-throughput sequencing (HTS) -technologieën. Whole-genome sequencing (WGS) benaderingen en bioinformatische hulpmiddelen hebben de exploratie van microbieel DNA betaalbaar en op grote schaal verbeterd, waardoor de diepgaande karakterisering van microben in één run is vergemakkelijkt, inclusief nauw verwante pathogene varianten 20,21,22. Afhankelijk van de biologische vragen kunnen verschillende bioinformatica-tools, algoritmen en databases worden gebruikt om gegevensanalyse uit te voeren. Als het hoofddoel bijvoorbeeld is om de aanwezigheid van ARGs, VFs en plasmiden te beoordelen, kunnen tools zoals ResFinder, VirulenceFinder en PlasmidFinder, samen met hun bijbehorende databases, een goed startpunt zijn. Carriço et ^al.22 gaven een gedetailleerd overzicht van de verschillende bioinformatica-software en gerelateerde databases die worden toegepast voor microbiële WGS-analyse, van ruwe datavoorbewerking tot fylogenetische inferentie.

Verschillende studies hebben het brede nut van WGS aangetoond voor genoomondervraging met betrekking tot antimicrobiële resistentieattributen, pathogeen potentieel en het volgen van de opkomst en evolutionaire relaties van klinisch relevante varianten van E. coli afkomstig van verschillende oorsprong 23,24,25,26 . WGS heeft de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische resistentie tegen antimicrobiële stoffen, inclusief die zeldzame of complexe resistentiemechanismen. Dit gebeurt door het detecteren van verworven ARG-varianten, nieuwe mutaties in geneesmiddeldoelgenen of promotorregio’s^27,28. Bovendien biedt WGS het potentieel om antimicrobiële resistentieprofielen af te leiden zonder voorafgaande kennis over het resistentiefenotype van een bacteriestam²⁹. Als alternatief heeft WGS de karakterisering van de mobiele genetische elementen (MGE’s) met zowel antimicrobiële resistentie als virulentiekenmerken mogelijk gemaakt, wat de bacteriële genoomevolutie van bestaande pathogenen heeft aangedreven. De toepassing van WGS tijdens het onderzoek naar de Duitse E. coli-uitbraak in 2011 resulteerde bijvoorbeeld in het blootleggen van de unieke genomische kenmerken van een schijnbaar nieuw E. coli-pathotype; interessant is dat die uitbraakstammen afkomstig waren van de enteroaggregatieve E. coli (EGA) -groep, die de profaag verwierf die codeert voor het Shiga-toxine van het enterohemorragische E. coli (EHEC) pathotype³⁰.

Dit werk presenteert een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS met behulp van een benchtop sequencer. Bovendien wordt een bioinformatica-pijplijn geleverd met behulp van webgebaseerde tools om de resulterende sequenties te analyseren en onderzoekers met beperkte of geen bioinformatica-expertise verder te ondersteunen. De beschreven methoden maakten het mogelijk om de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam ACM5, geïsoleerd in 2011 uit in het binnenland gekweekt Oreochromis spp. in Sinaloa, Mexico, op^{te helderen}.

Protocol

OPMERKING: De E. coli-stam ACM5 werd teruggevonden door het vismonster te verwerken en te kweken voor fecale coliforme (FC) bepaling12. Tijdens de visbemonstering vertoonden vissen geen klinische tekenen van ziekte, bacteriële of schimmelinfectie en heerste een gemiddelde temperatuur van 22,3 °C. Na isolatie werd het E. coli-isolaat onderworpen aan biochemische tests en gecryopreserveerd in hersenhartinfusie (BHI) bouillon met DMSO (8% v / v) als cryoprotectief middel. <p c…

Representative Results

De antimicrobiële gevoeligheid werd bepaald door de schijfdiffusiemethode en geïnterpreteerd door CLSI-breekpuntcriteria voor 12 antibiotica verspreid over zes verschillende antimicrobiële klassen, dat wil zeggen aminoglycosiden, β-lactams, fluoroquinolonen, nitrofuranen, fenicolen en folaatrouteantagonisten. De E. coli ACM5 vertoonde gevoeligheid voor alle antibiotica behalve één β-lactamgeneesmiddel. Vier β-lactamgeneesmiddelen werden getest: ampicilline, carbenicilline, cefalotheïne en cefotaxime. On…

Discussion

Deze studie presenteert een aanpassing van de bacteriële WGS-workflow met behulp van een benchtop sequencer en een pijplijn voor genomische karakterisering van een pathogene E. coli-variant . Afhankelijk van het gebruikte sequencingplatform kunnen de doorlooptijden (TATs) voor natte laboratoriumprocedures (bacteriekweek, gDNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing) en sequentieanalyse variëren, vooral als langzaam groeiende bacteriën worden bestudeerd. Volgens het hierboven beschreven protocol voor…

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)