Summary

Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Abstract

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en tilapia (Oreochromis spp.) landbouw vormt de belangrijkste zoetwatervisvariëteit die wordt gekweekt. Omdat aquacultuurpraktijken gevoelig zijn voor microbiële besmetting afgeleid van antropogene bronnen, is uitgebreid antibioticagebruik nodig, wat ertoe leidt dat aquacultuursystemen een belangrijke bron worden van antibioticaresistente en pathogene bacteriën van klinische relevantie, zoals Escherichia coli (E. coli). Hier werden de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam , hersteld van in het binnenland gekweekte Oreochromis spp., opgehelderd door middel van whole-genome sequencing (WGS) en in silico-analyse . Antimicrobiële gevoeligheidstests (ASAT) en WGS werden uitgevoerd. Bovendien werden fylogenetische groep, serotype, multilocussequentietypering (MLST), verworven antimicrobiële resistentie, virulentie, plasmide en profaaginhoud bepaald met behulp van diverse beschikbare webtools. Het E. coli-isolaat vertoonde alleen intermediaire gevoeligheid voor ampicilline en werd gekarakteriseerd als ONT:H21-B1-ST40-stam door op WGS gebaseerde typering. Hoewel slechts één antimicrobieel resistentie-gerelateerd gen werd gedetecteerd [mdf(A)], werden verschillende virulentie-geassocieerde genen (VAGs) van het atypische enteropathogene E. coli (aEPEC) pathotype geïdentificeerd. Bovendien werd de lading plasmide replicons uit grote plasmidegroepen en 18 profaag-geassocieerde regio’s gedetecteerd. Kortom, de WGS-karakterisering van een aEPEC-isolaat, hersteld van een viskwekerij in Sinaloa, Mexico, biedt inzicht in het pathogene potentieel en het mogelijke risico voor de menselijke gezondheid van het consumeren van rauwe aquaculturele producten. Het is noodzakelijk om next-generation sequencing (NGS) technieken te gebruiken voor het bestuderen van micro-organismen in het milieu en om een één gezondheidskader aan te nemen om te leren hoe gezondheidsproblemen ontstaan.

Introduction

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en de productiepraktijken zijn bedoeld om te voldoen aan de stijgende vraag naar voedsel voor menselijke consumptie. De wereldwijde aquacultuurproductie is verdrievoudigd van 34 miljoen ton (Mt) in 1997 tot 112 Mt in 20171. De belangrijkste soortengroepen, die bijdroegen aan bijna 75% van de productie, waren zeewier, karpers, tweekleppigen, meervallen en tilapia (Oreochromis spp.) 1. Het verschijnen van ziekten veroorzaakt door microbiële entiteiten is echter onvermijdelijk vanwege de intensieve viskweek, wat leidt tot potentiële economische verliezen2.

Antibioticagebruik in viskweekpraktijken staat bekend om het voorkomen en behandelen van bacteriële infecties, de belangrijkste beperkende factor in productiviteit 3,4. Niettemin hopen residuele antibiotica zich op in aquacultuursedimenten en water, waardoor selectieve druk wordt uitgeoefend en de vis-geassocieerde en de verblijvende bacteriële gemeenschappen worden gewijzigd 5,6,7,8. Bijgevolg dient de aquacultuuromgeving als reservoir voor antimicrobiële resistentiegenen (ARG’s) en de verdere opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën (ARB) in het omringende milieu9. Naast de bacteriële pathogenen die vaak worden waargenomen bij het kweken van vissen, worden leden van de Enterobacteriaceae-familie vaak aangetroffen, waaronder menselijke pathogene stammen van Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. en Salmonella spp.10. E. coli is het meest voorkomende micro-organisme geïsoleerd uit vismeel en water in de viskweek 11,12,13,14,15.

E. coli is een veelzijdige gramnegatieve bacterie die het maagdarmkanaal van zoogdieren en vogels bewoont als een commensaal lid van hun darmmicrobiota. E. coli bezit echter een zeer adaptief vermogen om te koloniseren en te volharden in verschillende milieuniches, waaronder bodem, sedimenten, voedsel en water16. Vanwege de genwinst en -verlies door het fenomeen horizontale genoverdracht (HGT), is E. coli snel geëvolueerd tot een goed aangepast antibioticumresistente ziekteverwekker, die een breed spectrum van ziekten bij mens en dier kan veroorzaken17,18. Op basis van de oorsprong van de isolatie worden pathogene varianten gedefinieerd als intestinale pathogene E. coli (InPEC) of extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC). Bovendien zijn InPEC en ExPEC onderverdeeld in goed gedefinieerde pathotypes op basis van ziektemanifestatie, genetische achtergrond, fenotypische eigenschappen en virulentiefactoren (VFs)16,17,19.

Traditionele kweek- en moleculaire technieken voor pathogene E. coli-stammen hebben de snelle detectie en identificatie van verschillende pathotypen mogelijk gemaakt. Ze kunnen echter tijdrovend, bewerkelijk en vaak een hoge technische training vereisen19. Bovendien kan geen enkele methode worden gebruikt om alle pathogene varianten van E. coli betrouwbaar te bestuderen vanwege de complexiteit van hun genetische achtergrond. Momenteel zijn deze nadelen overwonnen met de komst van high-throughput sequencing (HTS) -technologieën. Whole-genome sequencing (WGS) benaderingen en bioinformatische hulpmiddelen hebben de exploratie van microbieel DNA betaalbaar en op grote schaal verbeterd, waardoor de diepgaande karakterisering van microben in één run is vergemakkelijkt, inclusief nauw verwante pathogene varianten 20,21,22. Afhankelijk van de biologische vragen kunnen verschillende bioinformatica-tools, algoritmen en databases worden gebruikt om gegevensanalyse uit te voeren. Als het hoofddoel bijvoorbeeld is om de aanwezigheid van ARGs, VFs en plasmiden te beoordelen, kunnen tools zoals ResFinder, VirulenceFinder en PlasmidFinder, samen met hun bijbehorende databases, een goed startpunt zijn. Carriço et al.22 gaven een gedetailleerd overzicht van de verschillende bioinformatica-software en gerelateerde databases die worden toegepast voor microbiële WGS-analyse, van ruwe datavoorbewerking tot fylogenetische inferentie.

Verschillende studies hebben het brede nut van WGS aangetoond voor genoomondervraging met betrekking tot antimicrobiële resistentieattributen, pathogeen potentieel en het volgen van de opkomst en evolutionaire relaties van klinisch relevante varianten van E. coli afkomstig van verschillende oorsprong 23,24,25,26 . WGS heeft de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische resistentie tegen antimicrobiële stoffen, inclusief die zeldzame of complexe resistentiemechanismen. Dit gebeurt door het detecteren van verworven ARG-varianten, nieuwe mutaties in geneesmiddeldoelgenen of promotorregio’s27,28. Bovendien biedt WGS het potentieel om antimicrobiële resistentieprofielen af te leiden zonder voorafgaande kennis over het resistentiefenotype van een bacteriestam29. Als alternatief heeft WGS de karakterisering van de mobiele genetische elementen (MGE’s) met zowel antimicrobiële resistentie als virulentiekenmerken mogelijk gemaakt, wat de bacteriële genoomevolutie van bestaande pathogenen heeft aangedreven. De toepassing van WGS tijdens het onderzoek naar de Duitse E. coli-uitbraak in 2011 resulteerde bijvoorbeeld in het blootleggen van de unieke genomische kenmerken van een schijnbaar nieuw E. coli-pathotype; interessant is dat die uitbraakstammen afkomstig waren van de enteroaggregatieve E. coli (EGA) -groep, die de profaag verwierf die codeert voor het Shiga-toxine van het enterohemorragische E. coli (EHEC) pathotype30.

Dit werk presenteert een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS met behulp van een benchtop sequencer. Bovendien wordt een bioinformatica-pijplijn geleverd met behulp van webgebaseerde tools om de resulterende sequenties te analyseren en onderzoekers met beperkte of geen bioinformatica-expertise verder te ondersteunen. De beschreven methoden maakten het mogelijk om de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam ACM5, geïsoleerd in 2011 uit in het binnenland gekweekt Oreochromis spp. in Sinaloa, Mexico, opte helderen.

Protocol

OPMERKING: De E. coli-stam ACM5 werd teruggevonden door het vismonster te verwerken en te kweken voor fecale coliforme (FC) bepaling12. Tijdens de visbemonstering vertoonden vissen geen klinische tekenen van ziekte, bacteriële of schimmelinfectie en heerste een gemiddelde temperatuur van 22,3 °C. Na isolatie werd het E. coli-isolaat onderworpen aan biochemische tests en gecryopreserveerd in hersenhartinfusie (BHI) bouillon met DMSO (8% v / v) als cryoprotectief middel. <p c…

Representative Results

De antimicrobiële gevoeligheid werd bepaald door de schijfdiffusiemethode en geïnterpreteerd door CLSI-breekpuntcriteria voor 12 antibiotica verspreid over zes verschillende antimicrobiële klassen, dat wil zeggen aminoglycosiden, β-lactams, fluoroquinolonen, nitrofuranen, fenicolen en folaatrouteantagonisten. De E. coli ACM5 vertoonde gevoeligheid voor alle antibiotica behalve één β-lactamgeneesmiddel. Vier β-lactamgeneesmiddelen werden getest: ampicilline, carbenicilline, cefalotheïne en cefotaxime. On…

Discussion

Deze studie presenteert een aanpassing van de bacteriële WGS-workflow met behulp van een benchtop sequencer en een pijplijn voor genomische karakterisering van een pathogene E. coli-variant . Afhankelijk van het gebruikte sequencingplatform kunnen de doorlooptijden (TATs) voor natte laboratoriumprocedures (bacteriekweek, gDNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing) en sequentieanalyse variëren, vooral als langzaam groeiende bacteriën worden bestudeerd. Volgens het hierboven beschreven protocol voor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Aan de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie van Mexico (CONACyT door zijn acroniem in het Spaans) voor de doctoraatsbeurs toegekend aan José Antonio Magaña-Lizárraga [nr. 481143].

Materials

Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -. Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. . CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018)
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021)
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -. P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016)
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Play Video

Cite This Article
Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

View Video