Caractérisation d’une souche pathogène d’Escherichia coli dérivée d’Oreochromis spp. Fermes utilisant le séquençage du génome entier

Summary

La faisabilité de stratégies de séquençage du génome entier (SGE) à l’aide d’instruments de paillasse a simplifié l’interrogation du génome de chaque microbe pertinent pour la santé publique en laboratoire. Une adaptation méthodologique du flux de travail pour le séquençage bactérien est décrite et un pipeline bioinformatique pour l’analyse est également présenté.

Abstract

L’aquaculture est l’un des secteurs de production alimentaire à la croissance la plus rapide au monde et l’élevage du tilapia (Oreochromis spp.) constitue la principale variété de poissons d’eau douce cultivée. Étant donné que les pratiques aquacoles sont sensibles à la contamination microbienne provenant de sources anthropiques, l’utilisation intensive d’antibiotiques est nécessaire, ce qui fait que les systèmes aquacoles deviennent une source importante de bactéries résistantes aux antibiotiques et pathogènes d’importance clinique, telles que Escherichia coli (E. coli). Ici, la résistance aux antimicrobiens, la virulence et les caractéristiques de mobilome d’une souche pathogène d’E. coli , récupérée chez Oreochromis spp. d’élevage intérieur, ont été élucidées par séquençage du génome entier (WGS) et analyse in silico . Des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) et un séquençage pangénomique ont été effectués. De plus, le groupe phylogénétique, le sérotype, le typage de séquences multilocus (MLST), la résistance acquise aux antimicrobiens, la virulence, le plasmide et le contenu en prophages ont été déterminés à l’aide de divers outils Web disponibles. L’isolat d’E. coli ne présentait qu’une sensibilité intermédiaire à l’ampicilline et a été caractérisé comme étant la souche ONT:H21-B1-ST40 par typage à base de WGS. Bien qu’un seul gène lié à la résistance aux antimicrobiens ait été détecté [mdf(A)], plusieurs gènes associés à la virulence (VAG) du pathotype atypique E. coli entéropathogène (aEPEC) ont été identifiés . De plus, la cargaison de réplicons plasmidiques provenant de grands groupes plasmidiques et de 18 régions associées aux prophages a été détectée. En conclusion, la caractérisation WGS d’un isolat d’aEPEC, récupéré dans une ferme piscicole à Sinaloa, au Mexique, permet de mieux comprendre son potentiel pathogène et le risque possible pour la santé humaine de la consommation de produits aquacoles crus. Il est nécessaire d’exploiter les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier les micro-organismes environnementaux et d’adopter un cadre « Une seule santé » pour apprendre comment les problèmes de santé apparaissent.

Introduction

L’aquaculture est l’un des secteurs de production alimentaire à la croissance la plus rapide au monde, et ses pratiques de production visent à satisfaire la demande alimentaire croissante pour la consommation humaine. La production aquacole mondiale a triplé, passant de 34 millions de tonnes (Mt) en 1997 à 112 Mt en 2017¹. Les principaux groupes d’espèces, contribuant à près de 75% de la production, étaient les algues, les carpes, les bivalves, les poissons-chats et les tilapias (Oreochromis spp.) ¹. Cependant, l’apparition de maladies causées par des entités microbiennes est inévitable en raison de la pisciculture intensive, entraînant des pertes économiques potentielles².

L’utilisation d’antibiotiques dans les pratiques piscicoles est bien connue pour prévenir et traiter les infections bactériennes, principal facteur limitant la productivité ^3,4. Néanmoins, les antibiotiques résiduels s’accumulent dans les sédiments et l’eau de l’aquaculture, exerçant une pression sélective et modifiant les communautés bactériennes associées aux poissons et résidentes 5,6,7,8. Par conséquent, l’environnement aquacole sert de réservoir pour les gènes de résistance aux antimicrobiens (ARG) et la poursuite de l’émergence et de la propagation de bactéries résistantes aux antibiotiques (ARA) dans le milieu environnant⁹. En plus des bactéries pathogènes couramment observées affectant les pratiques piscicoles, des membres de la famille des Enterobacteriaceae sont souvent rencontrés, y compris des souches d’agents pathogènes humains d’Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. et Salmonella spp.10. E. coli est le microorganisme le plus commun isolé de la farine de poisson et de l’eau dans la pisciculture 11,12,13,14,15.

E. coli est une bactérie à Gram négatif polyvalente qui habite le tractus gastro-intestinal des mammifères et des oiseaux en tant que membre commensale de leur microbiote intestinal. Cependant, E. coli possède une capacité d’adaptation élevée pour coloniser et persister dans différentes niches environnementales, y compris le sol, les sédiments, les aliments et l’eau¹⁶. En raison du gain et de la perte de gènes par le phénomène de transfert horizontal de gènes (HGT), E. coli a rapidement évolué pour devenir un agent pathogène résistant aux antibiotiques bien adapté, capable de causer un large éventail de maladies chez les humains et les animaux^17,18. Sur la base de l’origine de l’isolement, les variantes pathogènes sont définies comme E. coli pathogène intestinal (InPEC) ou E. coli pathogène extra-intestinal (ExPEC). De plus, l’InPEC et l’ExPEC sont subdivisés en pathotypes bien définis en fonction de la manifestation de la maladie, du bagage génétique, des traits phénotypiques et des facteurs de virulence (VF)^16,17,19.

La culture traditionnelle et les techniques moléculaires pour les souches pathogènes d’E. coli ont permis la détection et l’identification rapides de différents pathotypes. Cependant, ils peuvent être longs, laborieux et nécessiter souvent une formation technique élevée¹⁹. De plus, aucune méthode unique ne peut être utilisée pour étudier de manière fiable toutes les variantes pathogènes d’E. coli en raison de la complexité de leur bagage génétique. Actuellement, ces inconvénients ont été surmontés avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit (HTS). Les approches de séquençage du génome entier (SGE) et les outils bioinformatiques ont amélioré l’exploration de l’ADN microbien à un coût abordable et à grande échelle, facilitant la caractérisation approfondie des microbes en une seule fois, y compris les variantes pathogènes étroitement apparentées^20,21,22. Selon les questions biologiques, plusieurs outils bioinformatiques, algorithmes et bases de données peuvent être utilisés pour effectuer l’analyse des données. Par exemple, si l’objectif principal est d’évaluer la présence d’ARG, de VF et de plasmides, des outils tels que ResFinder, VirulenceFinder et PlasmidFinder, ainsi que leurs bases de données associées, peuvent être un bon point de départ. Carriço et ^coll.22 ont donné un aperçu détaillé des différents logiciels bioinformatiques et des bases de données connexes appliqués à l’analyse microbienne du séquençage pangénomique, du prétraitement des données brutes à l’inférence phylogénétique.

Plusieurs études ont démontré la grande utilité du séquençage pangénomique pour l’interrogation du génome concernant les attributs de résistance aux antimicrobiens, le potentiel pathogène et le suivi de l’émergence et des relations évolutives de variantes cliniquement pertinentes d’E. coli provenant de diverses origines^23,24,25,26 . Le séquençage pangénomique a permis d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance phénotypique aux antimicrobiens, y compris les mécanismes de résistance rares ou complexes. Cela se fait en détectant des variantes ARG acquises, de nouvelles mutations dans les gènes cibles du médicament ou des régions promotrices^27,28. De plus, le séquençage pangénomique offre la possibilité d’inférer des profils de résistance aux antimicrobiens sans nécessiter de connaissances préalables sur le phénotype de résistance d’une souche bactérienne²⁹. Alternativement, le séquençage pangénomique a permis la caractérisation des éléments génétiques mobiles (MGE) porteurs à la fois de résistance aux antimicrobiens et de virulence, ce qui a entraîné l’évolution du génome bactérien des agents pathogènes existants. Par exemple, l’application du séquençage pangénomique lors de l’enquête sur l’éclosion d’E. coli en Allemagne en 2011 a permis de découvrir les caractéristiques génomiques uniques d’un pathotype apparemment nouveau d’E. coli; Il est intéressant de noter que ces souches d’éclosion provenaient du groupe E. coli entéroaggrégatif (EAEC), qui a acquis le prophage codant pour la toxine Shiga à partir du pathotype³⁰ d’E. coli entérohémorragique (EHEC).

Ce travail présente une adaptation méthodologique du flux de travail pour le séquenceur bactérien à l’aide d’un séquenceur de paillasse. De plus, un pipeline bioinformatique est fourni à l’aide d’outils Web pour analyser les séquences résultantes et soutenir davantage les chercheurs ayant peu ou pas d’expertise en bioinformatique. Les méthodes décrites ont permis d’élucider la résistance aux antimicrobiens, la virulence et les caractéristiques de mobilome d’une souche pathogène d’E. coli ACM5, isolée en 2011 chez Oreochromis spp. d’élevage intérieur à Sinaloa, au Mexique¹².

Protocol

REMARQUE : La souche ACM5 d’E. coli a été récupérée par traitement et culture de l’échantillon de poisson pour la détermination des coliformes fécaux (FC)12. Au cours de l’échantillonnage des poissons, les poissons n’ont pas présenté de signes cliniques de maladie, d’infection bactérienne ou fongique, et une température moyenne de 22,3 °C a prévalu. Après isolement, l’isolat d’E. coli a été soumis à des tests biochimiques et cryoconservé dans un …

Representative Results

La sensibilité aux antimicrobiens a été déterminée par la méthode de diffusion du disque et interprétée par les critères de seuil CLSI pour 12 antibiotiques couvrant six classes antimicrobiennes distinctes, c’est-à-dire les aminoglycosides, les β-lactamines, les fluoroquinolones, les nitrofuranes, les phénicols et les antagonistes des voies folates. L’ACM5 d’E. coli a montré une sensibilité à tous les antibiotiques, sauf un médicament β-lactamines. Quatre médicaments à base de β-lactami…

Discussion

Cette étude présente une adaptation du flux de travail du séquenceur bactérien WGS à l’aide d’un séquenceur de paillasse et d’un pipeline pour la caractérisation génomique d’une variante pathogène d’E. coli. Selon la plateforme de séquençage utilisée, les délais d’exécution (TATs) pour les procédures de laboratoire humide (culture bactérienne, extraction d’ADNg, préparation de la bibliothèque et séquençage) et l’analyse de séquence peuvent varier, en particulier si des bacté…

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)