Клеточное сродство стабилизированной частицами эмульсии для повышения интернализации антигена
Summary
Для рационального проектирования эффективных адъювантов мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту, стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга (PNPE). PNPE обладал уникальной мягкостью и гидрофобным интерфейсом для мощного клеточного контакта и предлагал высокую нагрузку антигена, улучшая клеточное сродство системы доставки к антигенпрезентирующим клеткам и вызывая эффективную интернализацию антигенов.
Abstract
Клеточное сродство микро-/наночастиц является предпосылкой для клеточного распознавания, клеточного поглощения и активации, которые необходимы для доставки лекарств и иммунного ответа. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что влияние заряда, размера и формы твердых частиц на сродство клеток обычно рассматривается, но мы редко осознаем существенную роль мягкости, динамического явления реструктуризации и сложного интерфейсного взаимодействия в клеточном сродстве. Здесь мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту (PLGA) наночастиц-стабилизированную эмульсию Пикеринга (PNPE), которая преодолела недостатки жестких форм и имитировала гибкость и текучесть патогенов. Был разработан метод для проверки сродства PNPE к клеточным поверхностям и разработки последующей интернализации иммунными клетками. Сродство PNPE к биомиметическим внеклеточным везикулам (bEV) – замене дендритных клеток костного мозга (BMDC) – определяли с помощью микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D), что позволило в режиме реального времени контролировать адгезию клеточной эмульсии. Впоследствии PNPE использовался для доставки антигена (ovalbumin, OVA), а поглощение антигенов BMDC наблюдалось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Репрезентативные результаты показали, что PNPE немедленно снижал частоту (ΔF), когда он сталкивался с bEV, что указывает на быструю адгезию и высокое сродство PNPE к BMDC. PNPE показал значительно более сильное связывание с клеточной мембраной, чем микрочастицы PLGA (PMP) и адъювант AddaVax (обозначаемый как сурфактант-стабилизированная наноэмульсия [SSE]). Кроме того, благодаря усиленному клеточному сродству к иммуноцитам за счет динамических изменений кривизны и боковых диффузий поглощение антигена впоследствии было увеличено по сравнению с PMP и SSE. Этот протокол дает представление о разработке новых составов с высоким сродством клеток и эффективной интернализацией антигена, обеспечивая платформу для разработки эффективных вакцин.
Introduction
Для борьбы с эпидемическими, хроническими и инфекционными заболеваниями необходимо разработать эффективные адъюванты для профилактических и лечебных прививок 1,2. В идеале адъюванты должны обладать отличной безопасностью и иммунной активацией 3,4,5. Эффективное поглощение и процесс антигенов антигенпрезентирующими клетками (АПК) считаются важным этапом в нисходящих сигнальных каскадах и инициировании иммунного ответа 6,7,8. Следовательно, получение четкого понимания механизма взаимодействия иммунных клеток с антигенами и разработка адъювантов для усиления интернализации являются эффективными стратегиями повышения эффективности вакцин.
Микро-/наночастицы с уникальными свойствами были ранее исследованы как системы доставки антигенов для опосредования клеточного поглощения антигенов и клеточного взаимодействия с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами 9,10. При контакте с клетками системы доставки начинают взаимодействовать с внеклеточным матриксом и клеточной мембраной, что приводит к интернализации и последующим клеточным ответам11,12. Предыдущие исследования показали, что интернализация частиц происходит через адгезиюклеточной мембраны-частицы 13 с последующей гибкой деформацией клеточной мембраны и диффузией рецептора к поверхностной мембране14,15. В этих условиях свойства системы доставки зависят от сродства к БТР, что впоследствии влияет на количество поглощения16,17.
Чтобы получить представление о конструкции системы доставки для улучшения иммунного ответа, обширные усилия были сосредоточены на исследовании взаимосвязи между свойствами частиц и клеточным поглощением. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что твердые микро-/наночастицы с различными зарядами, размерами и формами часто изучаются в этом свете, в то время как роль текучести в интернализации антигена редко исследуется18,19. Фактически, во время адгезии мягкие частицы продемонстрировали динамические изменения кривизны и боковые диффузии для увеличения площади контакта для поливалентных взаимодействий, которые вряд ли могут быть воспроизведены твердыми частицами20,21. Кроме того, клеточные мембраны представляют собой фосфолипидные бислои (сфинголипиды или холестерин) в месте поглощения, а гидрофобные вещества могут изменять конформационную энтропию липидов, уменьшая количество энергии, необходимой дляклеточного поглощения 22,23. Таким образом, усиление подвижности и содействие гидрофобности системы доставки может быть эффективной стратегией усиления интернализации антигена для усиления иммунного ответа.
Пикерирующие эмульсии, стабилизированные твердыми частицами, собранными на границе раздела между двумя несмешивающимися жидкостями, широко используются в биологической области24,25. Фактически, агрегирующие частицы на границе раздела нефть/вода определяют формирование многоуровневых структур, которые способствуют многоуровневым системам доставки и клеточным взаимодействиям и в дальнейшем индуцируют многофункциональные физико-химические свойства при доставке лекарств. Из-за их деформируемости и боковой подвижности эмульсии Пикеринга, как ожидалось, войдут в мультивалентное клеточное взаимодействие с иммуноцитами и будут распознаны мембранными белками26. Кроме того, поскольку маслянистые мицелловые ядра в эмульсиях Пикеринга не полностью покрыты твердыми частицами, эмульсии Пикеринга обладают промежутками разных размеров между частицами на границе раздела масло/вода, что вызывает более высокую гидрофобность. Таким образом, крайне важно исследовать сродство эмульсий Пикеринга к БТР и подробно остановиться на последующей интернализации для разработки эффективных адъювантов.
Основываясь на этих соображениях, мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга PLGA (PNPE) в качестве системы доставки вакцины с текучестью, которая также помогла получить ценную информацию о сродстве PNPE к BMDC и клеточной интернализации. Адгезия биомиметических внеклеточных везикул (bEV; замена BMDC) к PNPE в режиме реального времени контролировалась методом без меток с использованием микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D). После характеристики сродства PNPE к BMDC для определения поглощения антигена была использована конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Результат показал более высокое сродство PNPE к BMDC и эффективную интернализацию антигена. Мы ожидали, что PNPE будет демонстрировать более высокое сродство к APC, что может лучше стимулировать интернализацию антигенов для усиления иммунных реакций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию масла/воды PLGA в качестве системы доставки для усиленной интернализации антигена. Подготовленный PNPE обладал плотно упакованной поверхностью для поддержки места посадки и уникальной мягкостью и текучестью для мощного клеточног…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Проектом, поддержанным Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), От 0 до 1 Оригинальный инновационный проект Программы фундаментальных передовых научных исследований Китайской академии наук (ZDBS-LY-SLH040), Фондом инновационных исследовательских групп Национального фонда естественных наук Китая (грант No 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
