הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר
Summary
שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.
Abstract
Aneuploidy היא החריגה הגנטית המובילה הגורמת להפלה מוקדמת וכישלון הריון בבני אדם. רוב הטעויות בהפרדת הכרומוזומים הגורמות לאנאופלואידיות מתרחשות במהלך מיוזה בביציות, אך עדיין לא ברור לחלוטין מדוע מיוזה ביצית מועדת לשגיאות. במהלך חלוקת התא, תאים מונעים טעויות בהפרדת הכרומוזומים על ידי הפעלת מחסום הרכבת הציר (SAC). מנגנון בקרה זה מסתמך על זיהוי חיבורי קינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) וחישת מתח שנוצר על ידי סיבי ציר. כאשר KT אינם מחוברים, ה- SAC מופעל ומונע התקדמות מחזור התא. ה-SAC מופעל תחילה על ידי MPS1 קינאז, אשר מפעיל את הגיוס וההיווצרות של קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC), המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1. לאחר מכן, MCC מתפזר לתוך הציטופלסמה ו sequesters CDC20, מפעיל קומפלקס / ציקלוזום מקדם anaphase (APC/C). ברגע ש-KT מתחברים למיקרוטובולים והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, CDC20 משתחרר, וה-APC/C מופעל, מה שגורם להתפרקות של ציקלין B וסקורין, ובכך מאפשר הופעת אנאפאזה. בהשוואה לתאים סומטיים, SAC בביציות אינו יעיל באותה מידה מכיוון שתאים יכולים לעבור אנאפאזות למרות שיש להם KT לא מחוברים. ההבנה מדוע ה- SAC מתירני יותר ואם מתירנות זו היא אחד הגורמים לטעויות בהפרדת כרומוזומים בביציות עדיין דורשת חקירה נוספת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלוש הטכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC בביציות עכבר. טכניקות אלה כוללות שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של MTs כדי להעריך את תגובת SAC, מעקב אחר השתקת SAC על ידי מעקב אחר הקינטיקה של הרס סקורין, והערכת הגיוס של MAD2 ל-KT על ידי אימונופלואורסצנציה. יחד, טכניקות אלה בודקות את מנגנוני הבדיקה הדרושים לייצור ביציות בריאות על ידי מתן הערכה מלאה של שלמות SAC.
Introduction
Aneuploidy, אשר נובע מטעויות בהפרדת כרומוזומים, הוא הגורם המוביל להפלות מוקדמות והוא קשור מאוד לטעויות במיוזה1. מיוזה נבדלת ממיטוזה מכיוון שהיא מורכבת משני סבבים של חלוקת תאים ללא שלב שכפול DNA מתערב. במיוזה I, כרומוזומים הומולוגיים נפרדים בעוד כרומטידים אחים נשארים יחד. בביציות, שלב זה נוטה לשגיאות, מה שמוביל לייצור ביציות אנופלואידיות2.
כדי למנוע שגיאות בהפרדת כרומוזומים, רוב סוגי התאים מפעילים מנגנון מעקב המשהה את מחזור התא, הנקרא מחסום הרכבת ציר (SAC). מנגנון זה חש את חיבורי הקינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) והמתח נוצר כאשר הכרומוזומים מכוונים באופן דו-קוטבי3. קינטוכורים לא מחוברים מעוררים תגובת SAC שמתחילה בגיוס MPS1, הרגולטור הראשי של SAC, לקינטוכורים 3,4. MPS1 יוזמת גיוס של רכיבי SAC אחרים, ופועלת כפלטפורמה ליצירת קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC). ה-MCC, המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1, מתפזר לתוך הציטופלסמה ומעכב את הפעלת APC/C על ידי תפיסת המפעיל שלו CDC20. ברגע שכל הקינטוכורים מחוברים ביציבות ל-MTs והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, וה-MCC מפרק ומשחרר CDC20, ובכך מאפשר הפעלת APC/C. APC/C פעיל משפיל את סקורין וציקלין B, שני שלבים מרכזיים בהפעלת הופעת אנאפאזה 5,6. בתאים סומטיים, ה-SAC מחמיר מכיוון שהוא מופעל על ידי קינטוחור יחיד שאינו מחובר ומספיק כדי לגרום למעצר מחזור התא6. עם זאת, במהלך מיוזה של ביציות, SAC הוא מתירני יותר, וביציות יכולות להיכנס anaphase I עם אחד או יותר kinetochores unconnected 6,7,8,9,10. ההבנה מדוע SAC מתירני יותר בביציות היא תחום מתמשך של התמקדות בתחום. מנגנונים הגורמים לפגמים בהפעלת SAC או השתקת SAC עלולים להוביל לטעויות בהפרדת הכרומוזומים או למעצר ממושך של מחזור התא ולמוות תאי. לכן, הערכת המנגנונים השומרים על שלמות SAC בביציות חשובה להבנת תהליך יצירת הביציות האופלואידיות הבריאות.
פרוטוקול זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC במיוזה של ביציות עכבר על ידי בחינת שלבים קריטיים שונים של המחסום. ראשית, מתוארת הערכת תגובת SAC לאחר גרימת הפעלת SAC. הפעלה זו מושגת על ידי יצירת kinetochores unattached באמצעות nocodazole, תרופה depolymerizes MTs11. שנית, שיטה לניטור השתקת SAC מתוארת על ידי מעקב אחר הדינמיקה של פירוק סקורין במהלך הבשלת הביציות. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקה מבוססת אימונופלואורסנציה כדי למדוד את הגיוס של MAD2, אחד מרכיבי MCC, לקינטוכורות. יחד, בדיקות אלה מעריכות באופן מקיף את שלמות SAC במהלך הבשלה מיוטית של ביציות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחסום הרכבת הציר הוא מנגנון בקרה קריטי במהלך חלוקת התא שנועד למנוע טעויות בהפרדת כרומוזומים. זה מאפשר לתא מספיק זמן לתקן קבצים מצורפים KT-MT לא תקינים. מיוזה בביציות היא תהליך נוטה לשגיאות, שבו רוב ההפרדה השגויה של הכרומוזומים מתרחשת במהלך מיוזה I, מה שמוביל ליצירת ביציות אנאופלואידיות שהן ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון לפרויקט זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R35GM136340 ל-KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
