माउस ओसाइट्स में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट अखंडता का मूल्यांकन
Summary
क्रोमोसोम अलगाव में त्रुटि अंडाणुओं में एक आम विशेषता है। इसलिए, स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट का अध्ययन स्वस्थ अंडे का उत्पादन करने के लिए आवश्यक तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सुराग देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस अंडाणुओं में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए तीन पूरक परखों का वर्णन करता है।
Abstract
एन्यूप्लोइडी मनुष्यों में प्रारंभिक गर्भपात और गर्भावस्था की विफलता का कारण बनने वाली प्रमुख आनुवंशिक असामान्यता है। क्रोमोसोम अलगाव में अधिकांश त्रुटियां जो एन्यूप्लोइडी को जन्म देती हैं, अंडाणुओं में अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होती हैं, लेकिन अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन त्रुटि-प्रवण क्यों है, यह अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है। कोशिका विभाजन के दौरान, कोशिकाएं स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट (एसएसी) को सक्रिय करके गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों को रोकती हैं। यह नियंत्रण तंत्र किनेटोकोर (केटी)-माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) संलग्नक का पता लगाने और स्पिंडल फाइबर द्वारा उत्पन्न तनाव को महसूस करने पर निर्भर करता है। जब केटी असंबद्ध होते हैं, तो एसएसी सक्रिय होती है और सेल-चक्र प्रगति को रोकती है। एसएसी को पहले एमपीएस 1 किनेज द्वारा सक्रिय किया जाता है, जो एमएडी 1, एमएडी 2, बीयूबी 3 और बीयूबीआर 1 से बना माइटोटिक चेकपॉइंट कॉम्प्लेक्स (एमसीसी) की भर्ती और गठन को ट्रिगर करता है। फिर, एमसीसी साइटोप्लाज्म में फैलता है और सीडीसी 20, एक एनाफ़ेज़-बढ़ावा देने वाले कॉम्प्लेक्स / साइक्लोसोम (एपीसी / सी) एक्टिवेटर को अनुक्रमित करता है। एक बार जब केटी सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़ जाते हैं और क्रोमोसोम मेटाफ़ेज़ प्लेट पर संरेखित हो जाते हैं, तो एसएसी को चुप कर दिया जाता है, सीडीसी 20 जारी किया जाता है, और एपीसी / सी सक्रिय होता है, जिससे साइक्लिन बी और सिक्योरिन का क्षरण होता है, जिससे एनाफ़ेज़ की शुरुआत होती है। दैहिक कोशिकाओं की तुलना में, अंडाणुओं में एसएसी उतना प्रभावी नहीं है क्योंकि कोशिकाएं असंबद्ध केटी होने के बावजूद एनाफेज से गुजर सकती हैं। यह समझना कि एसएसी अधिक अनुमेय क्यों है और यदि यह अनुमेयता अंडाणुओं में गुणसूत्र पृथक्करण त्रुटियों के कारणों में से एक है, अभी भी आगे की जांच की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस अंडाणुओं में एसएसी अखंडता का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए तीन तकनीकों का वर्णन करता है। इन तकनीकों में एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एमटी को डीपोलीमराइज करने के लिए नोकोडाज़ोल का उपयोग करना, सिक्युरिन विनाश के कैनेटीक्स का पालन करके एसएसी साइलेंसिंग को ट्रैक करना और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा केटी के लिए एमएडी 2 की भर्ती का मूल्यांकन करना शामिल है। साथ में ये तकनीक एसएसी अखंडता का पूर्ण मूल्यांकन प्रदान करके स्वस्थ अंडे का उत्पादन करने के लिए आवश्यक जांच तंत्र।
Introduction
एन्यूप्लोइडी, जो क्रोमोसोम अलगाव में त्रुटियों से उत्पन्न होती है, प्रारंभिक गर्भपात का प्रमुख कारण है और अर्धसूत्रीविभाजन1 में गलतियों से अत्यधिक जुड़ा हुआ है। अर्धसूत्रीविभाजन माइटोसिस से अलग है क्योंकि इसमें हस्तक्षेप डीएनए प्रतिकृति चरण के बिना कोशिका विभाजन के दो दौर होते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन I में, समरूप गुणसूत्र अलग होते हैं जबकि बहन क्रोमैटिड एक साथ रहते हैं। अंडाणुओं में, यह चरण त्रुटि-प्रवण है, जिससे एन्यूप्लोइड अंडे का उत्पादनहोता है।
क्रोमोसोम अलगाव त्रुटियों को रोकने के लिए, अधिकांश सेल प्रकार एक निगरानी तंत्र को सक्रिय करते हैं जो सेल चक्र को रोकता है, जिसे स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट (एसएसी) कहा जाता है। यह तंत्र किनेटोकोर (केटी)-सूक्ष्मनलिका (एमटी) संलग्नक को महसूस करता है और तनाव तब उत्पन्न होता है जब गुणसूत्रद्विध्रुवीय तरीके से उन्मुख होते हैं। असंबद्ध किनेटोकोर्स एक एसएसी प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं जो एसएसी के मास्टर नियामक एमपीएस 1 की भर्ती के साथ शुरू होता है। एमपीएस 1 अन्य एसएसी घटकों की भर्ती शुरू करता है, जो माइटोटिक चेकपॉइंट कॉम्प्लेक्स (एमसीसी) बनाने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है। एमएडी 1, एमएडी 2, बीयूबी 3 और बीयूबीआर 1 से बना एमसीसी, साइटोप्लाज्म में फैलता है और अपने एक्टिवेटर सीडीसी 20 को अनुक्रमित करके एपीसी / सी सक्रियण को रोकता है। एक बार जब सभी किनेटोकोर्स एमटी से स्थिर रूप से जुड़े होते हैं और क्रोमोसोम मेटाफ़ेज़ प्लेट पर संरेखित होते हैं, तो एसएसी को चुप कर दिया जाता है, और एमसीसी सीडीसी 20 को अलग और जारी करता है, जिससे एपीसी / सी सक्रियण की अनुमति मिलती है। सक्रिय एपीसी / सी सिक्युरिन और साइक्लिन बी को नीचा दिखाता है, एनाफ़ेज़ की शुरुआत 5,6 को ट्रिगर करने में दो महत्वपूर्ण कदम। दैहिक कोशिकाओं में, एसएसी कठोर होता है क्योंकि यह एकल असंबद्ध किनेटोकोर द्वारा सक्रिय होता है और सेल-चक्र गिरफ्तारी6 को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होता है। हालांकि, अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, एसएसी अधिक अनुमेय होता है, और अंडाणु एक या अधिक असंबद्ध किनेटोकोर्स 6,7,8,9,10 के साथ एनाफ़ेज़ आई में प्रवेश कर सकते हैं। यह समझना कि एसएसी अंडाणुओं में अधिक अनुमेय क्यों है, क्षेत्र में फोकस का एक सतत क्षेत्र है। तंत्र जो एसएसी सक्रियण या एसएसी साइलेंसिंग में दोष का कारण बनते हैं, गुणसूत्र अलगाव या लंबे समय तक सेल चक्र गिरफ्तारी और कोशिका मृत्यु में त्रुटियां पैदा कर सकते हैं। इसलिए, अंडाणुओं में एसएसी अखंडता को बनाए रखने वाले तंत्र का मूल्यांकन स्वस्थ, यूप्लोइड अंडे बनाने की प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
यह प्रोटोकॉल चेकपॉइंट के विभिन्न महत्वपूर्ण चरणों की जांच करके माउस ओओसाइट अर्धसूत्रीविभाजन में एसएसी अखंडता का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए तकनीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, एसएसी सक्रियण को प्रेरित करने के बाद एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन वर्णित है। यह सक्रियण नोकोडाज़ोल का उपयोग करके असंबद्ध किनेटोकोर्स उत्पन्न करके प्राप्त किया जाता है, एक दवा जो एमटी11 को डीपोलीमराइज करती है। दूसरा, एसएसी साइलेंसिंग की निगरानी करने की एक विधि को अंडाणु परिपक्वता के दौरान सिक्युरिन क्षरण की गतिशीलता को ट्रैक करके वर्णित किया गया है। अंत में, एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित परख को एमसीसी घटकों में से एक एमएडी 2 की भर्ती को मापने के लिए नियोजित किया जाता है। साथ में, ये परख व्यापक रूप से अंडाणु मीओटिक परिपक्वता के दौरान एसएसी अखंडता का आकलन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट कोशिका विभाजन के दौरान एक महत्वपूर्ण नियंत्रण तंत्र है जिसे क्रोमोसोम अलगाव त्रुटियों को रोकने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह सेल को अनुचित केटी-एमटी संलग्नक को सही करने के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के लिए वित्त पोषण राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R35GM136340 केएस) द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
