डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर का उपयोग करके परिपत्र आरएनए का परिमाणीकरण
Summary
यह प्रोटोकॉल डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके कोशिकाओं में परिपत्र आरएनए (सीआईआरएनए) स्तरों की सटीक मात्रा का निर्धारण करने के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) की विस्तृत विधि का वर्णन करता है।
Abstract
डिजिटल ड्रॉपलेट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (डीडी-पीसीआर) सबसे संवेदनशील परिमाणीकरण विधियों में से एक है; यह प्रतिक्रिया को लगभग 20,000 पानी-इन-ऑयल बूंदों में विभाजित करता है, और पीसीआर व्यक्तिगत बूंदों में होता है। डीडी-पीसीआर के पारंपरिक वास्तविक समय क्यूपीसीआर पर कई फायदे हैं, जिसमें कम-बहुतायत लक्ष्यों का पता लगाने में सटीकता में वृद्धि, परिमाणीकरण के लिए संदर्भ जीन को छोड़ना, नमूनों के लिए तकनीकी प्रतिकृति को समाप्त करना और नमूनों में अवरोधकों के लिए उच्च लचीलापन दिखाना शामिल है। हाल ही में, डीडी-पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और निदान के लिए लक्ष्य डीएनए या आरएनए को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक बन गया है। सर्कुलर आरएनए (सीआईआरएनए) हाल ही में खोजे गए सहसंयोजक रूप से बंद आरएनए अणुओं का एक बड़ा परिवार है जिसमें 5 ‘ और 3 ‘ सिरों की कमी होती है। उन्हें आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन और माइक्रोआरएनए के लिए स्पंज के रूप में कार्य करके जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, लगभग आरएनए शरीर के तरल पदार्थों में स्रावित होते हैं, और एक्सोन्यूक्लिज़ के लिए उनका प्रतिरोध उन्हें रोग निदान के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करता है। इस लेख का उद्देश्य यह दिखाना है कि कोशिकाओं में विशिष्ट परिपत्र आरएनए (सिरआरएनए) स्तरों को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर डिजाइन, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और डीडी-पीसीआर विश्लेषण कैसे किया जाए। अंत में, हम डीडी-पीसीआर का उपयोग करके सीआईआरएनए की सटीक मात्रा का प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और उपन्यास कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम में हालिया प्रगति ने गैर-कोडिंग आरएनए के बढ़ते परिवार के एक नए सदस्य की खोज की है, जिसे परिपत्र आरएनए (सीआईआरएनए) 1 कहा जाता है। जैसा कि नाम से पता चलता है, लगभग आरएनए एकल-फंसे आरएनए अणुओं का एक परिवार है जिसमें कोई मुक्त सिरा नहीं है। वे गैर-कैननिकल हेड-टू-टेल स्प्लिसिंग द्वारा बनाए जाते हैं जिन्हें बैक-स्प्लिसिंग कहा जाता है, जहां अपस्ट्रीम स्प्लिस स्वीकर्ता साइट डाउनस्ट्रीम स्प्लिस डोनर साइट के साथ सहसंयोजक रूप से जुड़ती है ताकि एक स्थिर आरएनए सर्कल 1,2 बनाया जा सके। इस प्रक्रिया को कई कारकों द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है, जिसमें गोलाकार एक्सॉन के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में मौजूद उल्टे अलु दोहराए जाने वाले तत्व शामिल हैं, या कुछ स्प्लिसिंग कारकों या आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) 2,3 द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है। एक्सोनिक या इनट्रोनिक अनुक्रम से विशेष रूप से उत्पन्न परिपत्र आरएनए को एक्सोनिक सर्आरएनए और सर्कुलर इनट्रोनिक आरएनए या सीआई-आरएनए के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जबकि कुछ एक्सॉनिक सर्आरएनए इंट्रोन को बनाए रखते हैं और उन्हें एक्सॉन-इंट्रॉन सर्आरएनए (ईआईसीआईआरआरएनए) 3,4 कहा जाता है। लगभग आरएनए के कार्य बहुमुखी हैं, जिसमें स्पंजिंग मिआरएनए और / या आरबीपी, प्रतिलेखन को विनियमित करना और पेप्टाइड्स 3,5,6,7 में अनुवाद करके सेलुलर फ़ंक्शन को विनियमित करना शामिल है। कई रिपोर्टों ने विभिन्न बीमारियों और शारीरिक प्रक्रियाओं में सीआईआरएनए के महत्व पर प्रकाश डालाहै। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न और एक्सोन्यूक्लिज़ पाचन के प्रतिरोध इसे रोग निदान के लिए एक कार्यात्मक बायोमार्कर बनाते हैं और इसका उपयोग उपयुक्त चिकित्सीय लक्ष्य8 के रूप में भी किया जा सकता है। स्वास्थ्य और रोगों को विनियमित करने में इसके महत्व को ध्यान में रखते हुए, सर्आरएनए अभिव्यक्ति का सटीक परिमाणीकरण समय की आवश्यकता है।
जैविक नमूनों में सीआईआरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई जैव रासायनिक विधियां विकसितकी गई हैं। सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए सबसे सुविधाजनक और व्यापक रूप से स्वीकृत तरीकों में से एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन है, जिसके बाद मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) डाइवर्जेंट प्राइमर जोड़े10 का उपयोग करता है। हालांकि, अधिकांश सीआईआरएनए रैखिक एमआरएनए की तुलना में कम बहुतायत में हैं, जो उन्हें11 की मात्रा निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण बनाता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने किसी दिए गए नमूने में सीआईआरएनए की संख्या को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) का उपयोग करने की मांग की। डीडी-पीसीआर एक उन्नत पीसीआर तकनीक है जो माइक्रोफ्लुइडिक्स सिद्धांत का पालन करती है; यह तेल में कई जलीय बूंदें उत्पन्न करता है, और पीसीआर प्रत्येक बूंद में एक व्यक्तिगत प्रतिक्रिया12 के रूप में होता है। प्रतिक्रिया अलग-अलग बूंदों में होती है और एक ड्रॉपलेट रीडर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है, जो रुचि के जीन के लिए सकारात्मक या नकारात्मक बूंदों की संख्यादेता है। यह रुचि के जीन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए सबसे संवेदनशील तकनीक है, भले ही किसी दिए गए नमूने में केवल एक प्रति हो। अवरोधकों के प्रति संवेदनशीलता में कमी, बेहतर परिशुद्धता, और परिमाणीकरण के लिए संदर्भ जीन को छोड़ना इसे पारंपरिक क्यूपीसीआर 13,14,15 की तुलना में अधिक फायदेमंद बनाता है। यह व्यापक रूप से रुचिके जीन 16,17 के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए एक शोध और नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। यहां, हम माउस सी 2 सी 12 मायोट्यूब को अलग करने और डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके माउस सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स के प्रसार में सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए विस्तृत डीडी-पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की खोज के साथ पिछले दशक में सीआईआरएनए अनुसंधान में वृद्धि हुई है। नतीजतन, इसे भविष्य के आरएनए चिकित्सीय के लिए एक संभावित अणु माना गया है। इसके अलावा, यह कैंसर और…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को इंस्टीट्यूट ऑफ लाइफ साइंसेज, डीबीटी अनुसंधान अनुदान (बीटी/पीआर 27622/एमईडी/30/1961/2018) और अमरेश सी पांडा को दिए गए वेलकम ट्रस्ट/डीबीटी इंडिया एलायंस फैलोशिप [आईए/आई/18/2/504017] से इंट्राम्यूरल फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। हम लेख को प्रूफरीडिंग करने के लिए अन्य प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
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