디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화
Summary
이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.
Abstract
디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd-PCR)은 가장 민감한 정량화 방법 중 하나입니다. 반응을 거의 20,000개의 유중수 방울로 분획하고 개별 액적에서 PCR이 발생합니다. dd-PCR은 기존의 실시간 qPCR에 비해 낮은 존재비 표적 검출의 정확도 향상, 정량화를 위한 참조 유전자 생략, 샘플에 대한 기술 복제 제거, 샘플의 억제제에 대한 높은 복원력 표시 등 몇 가지 장점이 있습니다. 최근 dd-PCR은 유전자 발현 분석 및 진단을 위해 표적 DNA 또는 RNA를 정확하게 정량화하는 가장 보편적 인 방법 중 하나가되었습니다. 원형 RNA(circRNA)는 5′ 및 3′ 말단이 없는 최근에 발견된 공유 결합 폐쇄 RNA 분자의 대가족입니다. 그들은 RNA 결합 단백질과 마이크로 RNA의 스폰지 역할을하여 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한 circRNA는 체액으로 분비되며 엑소뉴클레아제에 대한 내성으로 인해 질병 진단을 위한 바이오마커 역할을 합니다. 이 기사는 발산 프라이머 설계, RNA 추출, cDNA 합성 및 dd-PCR 분석을 수행하여 세포의 특정 원형 RNA(circRNA) 수준을 정확하게 정량화하는 방법을 보여주는 것을 목표로 합니다. 결론적으로, 우리는 dd-PCR을 사용하여 circRNA의 정확한 정량화를 입증합니다.
Introduction
RNA 시퀀싱 기술과 새로운 계산 알고리즘의 최근 발전은 원형 RNA(circRNA)1라고 하는 성장하는 비코딩 RNA 계열의 새로운 구성원을 발견했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 circRNA는 자유 끝이 없는 단일 가닥 RNA 분자 계열입니다. 이들은 백스플라이싱이라고 하는 비표준 헤드-투-테일 스플라이싱에 의해 형성되며, 여기서 상류 스플라이스 수용체 부위는 다운스트림 스플라이스 공여체 부위와 공유적으로 결합하여 안정적인 RNA 원 1,2를 형성합니다. 이 과정은 순환된 엑손의 상류 및 하류에 존재하는 거꾸로 된 Alu 반복 요소를 포함한 여러 요인에 의해 매개되거나 일부 스플라이싱 인자 또는 RNA 결합 단백질(RBP)2,3에 의해 매개될 수 있습니다. 엑소닉 또는 인트론 서열에서만 생성된 원형 RNA는 엑소닉 circRNA 및 원형 인트론 RNA 또는 ci-RNA로 분류되는 반면, 일부 엑소닉 circRNA는 인트론을 유지하며 엑손-인트론 circRNA(EIcircRNA)라고 합니다.3,4. circRNA의 기능은 스폰지 miRNA 및/또는 RBP, 전사 조절 및 펩티드 3,5,6,7로 번역하여 세포 기능을 조절하는 것을 포함하여 다면적입니다. 여러 보고서에서 다양한 질병 및 생리적 과정에서 circRNA의 중요성을 강조했습니다8. 또한, 조직 특이적 발현 패턴 및 엑소뉴클레아제 소화에 대한 내성은 질병 진단을 위한 기능적 바이오마커가 되며 적절한치료 표적으로도 사용될 수 있다8. 건강과 질병을 조절하는 데있어 그 중요성을 고려할 때, circRNA 발현의 정확한 정량화는 시간의 필요성입니다.
생물학적샘플에서 circRNA를 정량화하기 위해 여러 생화학적 방법이 개발되었습니다9. circRNA 정량화에 가장 편리하고 널리 사용되는 방법 중 하나는 역전사 후 발산 프라이머 쌍10을 사용하는 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)입니다. 그러나 대부분의 circRNA는 선형 mRNA에 비해 존재량이 적기 때문에 정량화하기가 어렵습니다11. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 주어진 샘플에서 circRNA의 수를 정확하게 정량화하고자했습니다. dd-PCR은 미세 유체 원리를 따르는 고급 PCR 기술입니다. 오일에 여러 개의 수성 방울을 생성하고 PCR은 개별 반응(12)으로서 각 액적에서 발생합니다. 반응은 개별 액적에서 발생하고 액적 판독기를 사용하여 분석되며, 이는 관심 유전자12에 대한 양성 또는 음성 액적의 수를 제공합니다. 주어진 샘플에 단 하나의 사본만 있는 경우에도 관심 유전자를 정확하게 정량화하는 가장 민감한 기술입니다. 억제제에 대한 민감도 감소, 정밀도 향상 및 정량화를 위한 참조 유전자 생략은 기존 qPCR13,14,15보다 유리합니다. 관심 유전자의 절대 정량화를위한 연구 및 진단 도구로 널리 사용되었습니다16,17. 여기에서는 발산 프라이머를 사용하여 마우스 C2C12 근관을 분화하고 마우스 C2C12 근아세포를 증식시키는 데 있어 circRNA 정량화를 위한 상세한 dd-PCR 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CircRNA 연구는 지난 10년 동안 고처리량 시퀀싱 기술의 발견으로 성장했습니다. 결과적으로, 그것은 미래의 RNA 치료제를위한 잠재적 인 분자로 간주되었습니다. 또한, 암 및 심혈관 질환 4,8을 비롯한 여러 질환에서 바이오마커로 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나 circRNA의 식별은 존재도가 낮고 모 mRNA9와 구별되는 특정 백스플라이스…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 생명 과학 연구소의 교내 자금, DBT 연구 보조금 (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) 및 Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017]이 Amaresh C. Panda에게 수여되었습니다. 기사를 교정해 주신 다른 실험실 구성원에게 감사드립니다.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
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