Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.
Abstract
Die digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd-PCR) ist eine der empfindlichsten Quantifizierungsmethoden; Es fraktioniert die Reaktion in fast 20.000 Wasser-in-Öl-Tröpfchen, und die PCR tritt in den einzelnen Tröpfchen auf. Die dd-PCR hat mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen real-time qPCR, einschließlich einer erhöhten Genauigkeit bei der Erkennung von Zielen mit geringer Abundanz, dem Weglassen von Referenzgenen für die Quantifizierung, der Eliminierung technischer Replikate für Proben und der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber Inhibitoren in den Proben. In jüngster Zeit hat sich die dd-PCR zu einer der beliebtesten Methoden zur genauen Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA für die Genexpressionsanalyse und -diagnostik entwickelt. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine große Familie von kürzlich entdeckten kovalent geschlossenen RNA-Molekülen ohne 5′ und 3′ Enden. Es wurde gezeigt, dass sie die Genexpression regulieren, indem sie als Schwämme für RNA-bindende Proteine und microRNAs fungieren. Darüber hinaus werden circRNAs in Körperflüssigkeiten sezerniert, und ihre Resistenz gegen Exonukleasen macht sie zu Biomarkern für die Krankheitsdiagnose. Dieser Artikel soll zeigen, wie divergentes Primer-Design, RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und dd-PCR-Analyse durchgeführt werden können, um spezifische zirkuläre RNA (circRNA) -Spiegel in Zellen genau zu quantifizieren. Abschließend demonstrieren wir die genaue Quantifizierung von circRNAs mittels dd-PCR.
Introduction
Jüngste Fortschritte bei RNA-Sequenzierungstechnologien und neuartigen Computeralgorithmen haben ein neues Mitglied der wachsenden Familie nicht-kodierender RNAs entdeckt, die als zirkuläre RNA (circRNA)1 bezeichnet wird. Wie der Name schon sagt, sind circRNAs eine Familie von einzelsträngigen RNA-Molekülen ohne freie Enden. Sie werden durch nicht-kanonisches Kopf-zu-Schwanz-Spleißen gebildet, das als Back-Splicing bezeichnet wird, bei dem sich die vorgeschaltete Spleißakzeptorstelle kovalent mit der nachgeschalteten Spleißspenderstelle verbindet, um einen stabilen RNA-Kreis 1,2 zu bilden. Dieser Prozess könnte durch mehrere Faktoren vermittelt werden, einschließlich invertierter Alu-Repetitionselemente, die im Upstream und Downstream von zirkularisierten Exons vorhanden sind, oder kann durch einige Spleißfaktoren oder RNA-bindende Proteine (RBPs) vermittelt werden2,3. Zirkuläre RNAs, die ausschließlich aus der exonischen oder intronischen Sequenz erzeugt werden, werden als exonische circRNA und zirkuläre intronische RNAs oder ci-RNAs klassifiziert, während einige exonische circRNAs das Intron behalten und als Exon-Intron-circRNAs (EIcircRNAs) bezeichnet werden3,4. Die Funktionen von circRNAs sind vielfältig, einschließlich der Schwammbildung von miRNA und/oder RBP, der Regulierung der Transkription und der Regulierung der zellulären Funktion durch Übersetzung in Peptide 3,5,6,7. Mehrere Berichte haben die Bedeutung von circRNAs bei verschiedenen Krankheiten und physiologischen Prozessen hervorgehoben8. Darüber hinaus machen gewebespezifische Expressionsmuster und Resistenz gegen Exonuklease-Verdauung es zu einem funktionellen Biomarker für die Krankheitsdiagnostik und kann auch als geeignetes therapeutisches Ziel verwendet werden8. In Anbetracht seiner Bedeutung für die Regulierung von Gesundheit und Krankheiten ist die genaue Quantifizierung der circRNA-Expression das Gebot der Stunde.
Mehrere biochemische Methoden wurden entwickelt, um circRNAs in biologischen Proben zu quantifizieren9. Eine der bequemsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur circRNA-Quantifizierung ist die reverse Transkription gefolgt von einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung divergenter Primerpaare10. Die Mehrheit der circRNAs ist jedoch im Vergleich zu linearen mRNAs in geringer Häufigkeit, was es schwierig macht, sie zu quantifizieren11. Um dieses Problem zu lösen, haben wir versucht, die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zu verwenden, um die Anzahl der circRNAs in einer bestimmten Probe genau zu quantifizieren. Die dd-PCR ist eine fortschrittliche PCR-Technologie, die dem Prinzip der Mikrofluidik folgt. es erzeugt mehrere wässrige Tröpfchen in Öl, und die PCR tritt in jedem Tröpfchen als individuelle Reaktion auf12. Die Reaktion erfolgt in einzelnen Tröpfchen und wird mit einem Tröpfchenleser analysiert, der die Anzahl der positiven oder negativen Tröpfchen für das interessierende Gen12 angibt. Es ist die empfindlichste Technik, um ein Gen von Interesse genau zu quantifizieren, auch wenn es nur eine einzige Kopie in einer bestimmten Probe gibt. Verminderte Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, bessere Präzision und das Weglassen des Referenzgens für die Quantifizierung machen es vorteilhafter als herkömmliche qPCR13,14,15. Es wurde häufig als Forschungs- und Diagnosewerkzeug für die absolute Quantifizierung eines interessierenden Gensverwendet 16,17. Hier beschreiben wir das detaillierte dd-PCR-Protokoll für die circRNA-Quantifizierung bei der Differenzierung von C2C12-Myotuben der Maus und proliferierenden C2C12-Myoblasten der Maus unter Verwendung divergenter Primer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die CircRNA-Forschung ist in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien gewachsen. Daher wurde es als potenzielles Molekül für zukünftige RNA-Therapeutika angesehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass es als Biomarker bei mehreren Krankheiten wirkt, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4,8. Die Identifizierung von circRNA ist jedoch aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwierig und sie hat nur eine s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Institute of Life Sciences, das DBT-Forschungsstipendium (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) und das Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] unterstützt, das an Amaresh C. Panda vergeben wurde. Wir danken anderen Labormitgliedern für das Korrekturlesen des Artikels.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
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