Denne protokollen beskriver den detaljerte metoden for digital dråpe-PCR (dd-PCR) for presis kvantifisering av sirkulære RNA (circRNA) nivåer i celler ved hjelp av divergerende primere.
Digital dråpepolymerasekjedereaksjon (dd-PCR) er en av de mest følsomme kvantifiseringsmetodene; det fraksjonerer reaksjonen i nesten 20.000 vann-i-olje-dråper, og PCR forekommer i de enkelte dråpene. DD-PCR har flere fordeler i forhold til konvensjonell sanntids qPCR, inkludert økt nøyaktighet i å oppdage mål med lav overflod, utelate referansegener for kvantifisering, eliminere tekniske replikasjoner for prøver og vise høy motstandskraft mot hemmere i prøvene. Nylig har dd-PCR blitt en av de mest populære metodene for nøyaktig kvantifisering av mål-DNA eller RNA for genuttrykksanalyse og diagnostikk. Sirkulære RNA (circRNA) er en stor familie av nylig oppdagede kovalent lukkede RNA-molekyler som mangler 5 ‘og 3’ ender. De har vist seg å regulere genuttrykk ved å fungere som svamper for RNA-bindende proteiner og mikroRNA. Videre utskilles circRNA i kroppsvæsker, og deres motstand mot eksonukleaser gjør at de tjener som biomarkører for sykdomsdiagnose. Denne artikkelen tar sikte på å vise hvordan man utfører divergerende primerdesign, RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese og dd-PCR-analyse for å nøyaktig kvantifisere spesifikke sirkulære RNA (circRNA) nivåer i celler. Avslutningsvis demonstrerer vi den nøyaktige kvantifiseringen av circRNA ved bruk av dd-PCR.
Nylige fremskritt innen RNA-sekvenseringsteknologier og nye beregningsalgoritmer har oppdaget et nytt medlem av den voksende familien av ikke-kodende RNAer, kalt sirkulær RNA (circRNA)1. Som navnet antyder, er circRNA en familie av enkeltstrengede RNA-molekyler uten frie ender. De dannes av ikke-kanonisk spleising fra hode til hale kalt back-splicing, hvor oppstrøms spleiseakseptorstedet går sammen med nedstrøms spleisedonorstedet for å danne en stabil RNA-sirkel 1,2. Denne prosessen kan være mediert av flere faktorer, inkludert inverterte Alu-repeterende elementer som er tilstede i oppstrøms og nedstrøms sirkulæriserte eksoner, eller kan medieres av noen spleisingsfaktorer eller RNA-bindende proteiner (RBP) 2,3. Sirkulære RNA generert utelukkende fra den eksoniske eller introniske sekvensen klassifiseres som eksoniske circRNA og sirkulære introniske RNA eller ci-RNA, mens noen eksoniske circRNAer beholder intronet og kalles ekson-intron circRNA (EIcircRNAs)3,4. Funksjonene til circRNA er mangefasetterte, inkludert sponging miRNA og / eller RBP, regulering av transkripsjon og regulering av cellulær funksjon ved å oversette til peptider 3,5,6,7. Flere rapporter har fremhevet betydningen av circRNA i ulike sykdommer og fysiologiske prosesser8. Videre gjør vevsspesifikke uttrykksmønstre og motstand mot eksonukleasefordøyelse det til en funksjonell biomarkør for sykdomsdiagnose, og den kan også brukes som et egnet terapeutisk mål8. Med tanke på dens betydning for å regulere helse og sykdommer, er den nøyaktige kvantifiseringen av circRNA-uttrykk behovet for timen.
Det er utviklet flere biokjemiske metoder for å kvantifisere circRNA i biologiske prøver9. En av de mest praktiske og allment aksepterte metodene for circRNA-kvantifisering er revers transkripsjon etterfulgt av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved bruk av divergerende primerpar10. Imidlertid er flertallet av circRNA i lav overflod sammenlignet med lineære mRNA, noe som gjør det utfordrende å kvantifisere dem11. For å løse dette problemet søkte vi å bruke digital dråpe-PCR (dd-PCR) for å kvantifisere antall circRNA i en gitt prøve nøyaktig. DD-PCR er en avansert PCR-teknologi som følger mikrofluidikkprinsippet; det genererer flere vandige dråper i olje, og PCR forekommer i hver dråpe som en individuell reaksjon12. Reaksjonen skjer i individuelle dråper og analyseres ved hjelp av en dråpeleser, som gir antall positive eller negative dråper for genet av interesse12. Det er den mest følsomme teknikken for å nøyaktig kvantifisere et gen av interesse, selv om det bare er en enkelt kopi i en gitt prøve. Redusert følsomhet overfor inhibitorer, bedre presisjon og utelatelse av referansegenet for kvantifisering gjør det mer fordelaktig enn konvensjonell qPCR13,14,15. Det har blitt mye brukt som et forsknings- og diagnostisk verktøy for absolutt kvantifisering av et gen av interesse16,17. Her beskriver vi den detaljerte dd-PCR-protokollen for circRNA-kvantifisering ved differensiering av mus C2C12 myotuber og prolifererende mus C2C12 myoblaster ved bruk av divergerende primere.
CircRNA-forskning har vokst det siste tiåret med oppdagelsen av sekvenseringsteknologier med høy gjennomstrømning. Som et resultat har det blitt ansett som et potensielt molekyl for fremtidige RNA-terapier. I tillegg er det kjent å fungere som en biomarkør ved flere sykdommer, inkludert kreft og hjerte- og karsykdommer 4,8. Imidlertid er identifiseringen av circRNA vanskelig på grunn av sin lave overflod, og den har bare en spesifikk tilbakeslagskrysssekven…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av intramural finansiering fra Institute of Life Sciences, DBT forskningsstipend (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018), og Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2 / 504017] tildelt Amaresh C. Panda. Vi takker andre laboratoriemedlemmer for korrekturlesing av artikkelen.
1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
Filter Tips | Tarson | 528104 | |
DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
Chloroform | SRL | 96764 | |
DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |