Un modèle de culture cellulaire primaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine pour l’étude de l’AVC ischémique in vitro

Summary

Ici, nous décrivons la méthode pour établir un modèle de culture triple cellulaire de la barrière hémato-encéphalique basé sur les cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau humain, les astrocytes et les péricytes. Ce modèle multicellulaire est adapté aux études de dysfonctionnement de l’unité neurovasculaire lors d’un AVC ischémique in vitro ou au criblage de candidats médicaments.

Abstract

L’AVC ischémique est une cause majeure de décès et d’invalidité dans le monde entier avec des options thérapeutiques limitées. La neuropathologie de l’AVC ischémique se caractérise par une interruption de l’apport sanguin au cerveau entraînant la mort cellulaire et un dysfonctionnement cognitif. Pendant et après un AVC ischémique, le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) facilite la progression des blessures et contribue à une mauvaise récupération du patient. Les modèles actuels de BHE comprennent principalement des monocultures endothéliales et des co-cultures doubles avec des astrocytes ou des péricytes.

De tels modèles n’ont pas la capacité d’imiter pleinement un microenvironnement cérébral dynamique, ce qui est essentiel pour la communication de cellule à cellule. De plus, les modèles de BHE couramment utilisés contiennent souvent des cellules endothéliales humaines immortalisées ou des cultures cellulaires d’origine animale (rongeurs, porcins ou bovins) qui posent des limites translationnelles. Cet article décrit un nouveau modèle de BHE bien inséré contenant uniquement des cellules humaines primaires (cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, astrocytes et péricytes vasculaires cérébraux) permettant d’étudier les lésions cérébrales ischémiques in vitro.

Les effets de la privation d’oxygène-glucose (OGD) sur l’intégrité de la barrière ont été évalués par perméabilité passive, mesures de résistance électrique transendothéliale (TEER) et visualisation directe des cellules hypoxiques. Le protocole présenté offre un avantage distinct en imitant l’environnement intercellulaire de la BHE in vivo, servant de modèle de BHE in vitro plus réaliste pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre d’une lésion cérébrale ischémique.

Introduction

L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité de longue durée dans le monde¹. L’incidence des accidents vasculaires cérébraux augmente rapidement avec l’âge, doublant tous les 10 ans après l’âge de 55 ans². L’AVC ischémique survient à la suite d’une perturbation du flux sanguin cérébral due à des événements thrombotiques et emboliques, qui englobe plus de 80% de tous les cas d’AVC³. Même maintenant, il existe relativement peu d’options de traitement disponibles pour minimiser la mort tissulaire après un AVC ischémique. Les traitements existants sont sensibles au facteur temps et, par conséquent, ne conduisent pas toujours à de bons résultats cliniques. Par conséquent, il est urgent de mener des recherches sur les mécanismes cellulaires complexes de l’AVC ischémique qui affectent la récupération après un AVC.

La BHE est une interface dynamique pour l’échange de molécules entre le sang et le parenchyme cérébral. Structurellement, la BHE est composée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales interconnectées par des complexes jonctionnels entourés d’une membrane basale, de péricytes et d’extrémités astrocytaires⁴. Les péricytes et les astrocytes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la BHE par la sécrétion de divers facteurs nécessaires à la formation de jonctions fortes et serrées ^5,6. La dégradation de la BHE est l’une des caractéristiques de l’AVC ischémique. La réponse inflammatoire aiguë et le stress oxydatif associés à l’ischémie cérébrale entraînent la perturbation des complexes protéiques de jonction serrée et une diaphonie dérégulée entre les astrocytes, les péricytes et les cellules endothéliales, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité du soluté paracellulaire à travers la BHE⁷. Le dysfonctionnement de la BHE favorise davantage la formation d’œdème cérébral et augmente le risque de transformation hémorragique⁸. Compte tenu de tout ce qui précède, il y a un grand intérêt à comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent au niveau de la BHE pendant et après un AVC ischémique.

Bien que de nombreux modèles de BHE in vitro aient été développés au cours des dernières décennies et utilisés dans diverses études, aucun d’entre eux ne peut reproduire pleinement les conditions in vivo ⁹. Alors que certains modèles sont basés sur des monocouches de cellules endothéliales cultivées sur des supports perméables bien insérés seuls ou en combinaison avec des péricytes ou des astrocytes, seules des études plus récentes ont introduit des modèles de culture triple cellulaire. Presque tous les modèles de BHE à triple culture existants incorporent des cellules endothéliales cérébrales primaires ainsi que des astrocytes et des péricytes isolés d’espèces animales ou des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines^10,11,12,13.

Reconnaissant la nécessité de mieux récapituler la BHE humaine in vitro, nous avons établi un modèle de culture de cellules triples in vitro composé de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC), d’astrocytes humains primaires (HA) et de péricytes vasculaires cérébraux humains primaires (HBVP). Ce modèle BBB à triple culture est installé sur des plaquettes à 6 puits, des inserts de membrane en polyester avec une taille de pores de 0,4 μm. Ces inserts de puits fournissent un environnement optimal pour la fixation des cellules et permettent un accès facile aux compartiments apical (sang) et basolatéral (cerveau) pour un échantillonnage moyen ou une application composée. Les caractéristiques de ce modèle de triple culture de cellules BBB proposé sont évaluées en mesurant le TEER et le flux paracellulaire post-OGD imitant l’AVC ischémique in vitro, avec une pénurie d’oxygène (<1% O₂) et de nutriments (en utilisant un milieu sans glucose) obtenue en utilisant une chambre humidifiée et scellée. De plus, les conditions induites de type ischémique dans ce modèle sont vérifiées avec précision par visualisation directe des cellules hypoxiques.

Protocol

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les cellules, matériaux, équipements et solutions utilisés dans ce protocole. 1. Réglage du modèle BBB à triple culture cellulaire Ensemencement des péricytesCultiver le HBVP dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C jusqu’à confluent. Une fois la confluenc…

Representative Results

Pour examiner les effets des astrocytes et des péricytes sur la fonction barrière de HBMEC, nous avons construit le modèle de culture triple cellule BBB sur des inserts de culture cellulaire (Figure 1A) avec la monoculture HBMEC et deux modèles de double co-culture comme témoins (Figure 1B). Les contrôles de co-culture double comprenaient une co-culture sans contact de HBMEC avec HA et une co-culture de contact de HBMEC avec HBVP. Après 6 jours en co-cult…

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour mettre en place un modèle fiable de culture BBB à triple cellule endothéliale-péricyte-astrocyte pour étudier le dysfonctionnement de la BHE dans le cadre d’un AVC ischémique in vitro. Considérant que les péricytes sont les plus proches voisins des cellules endothéliales in vivo, les HBVP sont plaqués sur la face inférieure des inserts de puits dans ce modèle¹⁶. Bien que cette configuration n’ait pas la communic…

Materials

24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL